猪ARAF基因真核表达及其对PK15细胞凋亡的调控作用

为研究猪ARAF(v-raf murine sarcoma 3611 viral oncogene homo)lo基g因在PK15细胞的表达、定位及其对细胞凋亡的调控作用,本文以PK15细胞为研究对象,RT-PCR扩增猪ARAF基因CDS序列,经TA克隆至载体pGEM-T-Easy,随后加酶切位点和保护性碱基设计引物,PCR扩增后,构建重组真核表达载体pc DNA3.1-EGFP-ARAF,重组载体经脂质体法转染PK15细胞,荧光显微镜观察转染效果,qPCR与Westernblot分别检测A R A F基因mRNA和蛋白表达水平,间接免疫荧光试验观察猪A R A F的亚细胞定位;同时,流式细胞术及免疫印迹试验探究ARAF对PK15细胞凋亡的影响。结果显示,构建的重组真核表达载体转染成功,荧光显微镜检查可见转染组和空载组细胞均表达绿色荧光蛋白。转染组细胞ARAF基因mRNA及蛋白表达量较空载组和空白对照组显著升高(P<0.01)。激光共聚焦显微镜观察到该基因表达蛋白主要定位于PK15细胞胞质中。流式细胞术及免疫印迹试验检测时可见转染组PK15细胞凋亡率显著增加;相较空载组和空白对照组,转染组细胞中凋亡相关蛋白BAD(B-cell lymphoma-2 antagonist of cell d)e、aBtchl-2(B-cell lymphoma-2)蛋白的表达量无显著性变化,而BAX(B-cell lymphoma-2 associated)X、Cleaved caspase-3的蛋白表达量显著升高(P<0.01),显示高表达ARAF基因可促进PK15细胞的凋亡。上述研究结果为进一步深入探讨ARAF基因对PK15细胞凋亡的调控机制研究奠定了重要基础。