甘蓝自交不亲和信号传导中SRK底物ARC1蛋白编码序列的克隆与分析

以甘蓝自交不亲和系 2 0 0 10 197的植株为材料 ,提取幼苗中的gDNA及花蕾期的柱头、子房、花瓣、叶片、根的mRNA ,并对mRNA进行反转录合成cDNA ,然后以gDNA与cDNA为模板扩增ARC1蛋白编码序列。结果表明只在gDNA与花期柱头mRNA的反转录cDNA中扩增出产物 ,而在其他组织中无任何产物。这可能说明甘蓝ARC1蛋白编码序列是在柱头特异性表达的。在甘蓝中克隆的ARC1Boler基因与GenBank中公布的油菜的ARC1基因序列的同源性为 94 %。其ARC1蛋白编码序列只有一个单一的开放阅读框 ,无内含子存在。甘蓝的ARC1Boler基因编码的氨基酸序列与油菜和拟南芥的同源性分别为 85 %和 5 2 %。这说明ARC1基因的属间差异明显大于种间差异。此外 ,在ARC1Boler、ARC1和ARC1At基因编码的蛋白质中均存在 ,Ubox结构和臂重复结构。Ubox结构均位于氨基酸序列的中间区域 ,这个区域有可能是蛋白质发生二聚化的区域。在ARC1Boler和ARC1基因编码的蛋白质C端存在 5个臂重复区段 ,而在ARC1At基因编码的蛋白质中只有 1个。这种差异的存在 ,也可能是ARC1At与ARC1Boler和ARC1功能不同的根本原因。

甘蓝自交不亲和信号传导元件ARC1的体外表达及其与SRK相互作用验证

在甘蓝自交不亲和信号传导中ARC1和上游因子SRK之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用,以甘蓝E1为材料,采用RT-PCR技术扩增ARC1的编码序列,构建ARC1原核表达质粒pET43.1a-ARC1,转化宿主菌大肠杆菌BL21,通过SDS-PAGE检测该蛋白的表达。利用免疫共沉淀原理及pET43.1a-ARC1融合蛋白序列中的6×His标签与Ni+结合的特点建立了体外检测蛋白质相互作用的新方法,并用该方法对ARC1与SRK的相互作用进行了检测。结果表明,在体外ARC1能与SRK相互作用并形成复合体,这为深入分析ARC1与SRK相互作用机理以及探讨ARC1与下游传导元件的相互作用提供了理论和技术基础。