垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

利用特异性的引物对 ,选择性扩增垃圾填埋场渗滤液中古细菌群落的 1 6 S r RNA基因片断 ,在此基础上建立 1 6 Sr DNA克隆文库。经古细菌通用寡核苷酸探针的原位杂交筛选后 ,克隆文库内古细菌 1 6 S r DNA扩增片断的多样性通过ARDRA分析 ( amplified r DNA restriction analysis)而获得。利用 PCR将各重组克隆子内的 1 6 S r DNA外源片断再扩增出来后 ,两种限制性内切酶 -H ha 和 H ae -被分别用于 1 6 Sr DNA克隆片断的限制酶切分析。结果表明 ,随机选出的 70个古细菌 1 6 S r DNA克隆片断被分为 2 1个不同的 ARDRA型 (组 ) ,其中的两个优势型总共占了所有被分析克隆子的6 0 % ,而其余 1 9个型的相对丰度均处于较低的水平 ,当中的 1 4个型更仅含有 1个克隆子。通过对 1 6 Sr RNA基因的 PCR扩增、克隆及其 ARDRA分析 。

ARDRA对植物根瘤内共生放线菌Frankia多样性的研究

应用原核生物 16SrDNA特异性引物rD1和fD1,通过ARDRA (amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis)法直接扩增自中国云南、东北地区赤杨属 3种植物和沙棘属 1种植物根瘤内FrankiaDNA ,得到一长约 15 0 0bp的扩增产物 .选用两种内切酶HaeⅢ、AfaⅠ联合对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱 .将所测48个感染赤杨的Frankia样本区分为 3个不同的组 ,所测 43个感染沙棘的Frankia样本区分为 3个不同的组 .显示根瘤内Frankia存在丰富的遗传多样性 .

ARDRA方法在荧光假单胞菌分离鉴定中的应用

【目的】探索荧光假单胞菌的分类方法,分离筛选拮抗性较强的荧光假单胞菌。【方法】利用紫外下产生荧光的特性,采用梯度稀释及鞭毛染色的方法,对采自云南、海南、山东和新疆的488份植物根际土壤进行分离筛选,分离菌株进行ARDRA分析,采用室内平板对峙法筛选对植物病原真菌具有较强拮抗作用的菌株,并对其进行生理生化分析和分子鉴定。【结果】分离筛选到102株紫外下产生荧光的杆状单极生鞭毛菌株。ARDRA分析产生荧光假单胞菌类型、恶臭假单胞菌类型以及一个未知的谱带类型。以油菜立枯病菌作为靶标菌,筛选到25株具有拮抗作用的菌株,其中TC222产生的抑菌圈最大,进一步的生测结果表明该菌株对9种重要的植物病原真菌如番茄灰霉病菌等具有很强的拮抗活性。TC222的16SrDNA核苷酸序列与荧光假单胞菌PfO-1同源性达到99%,其最终鉴定为荧光假单胞菌。【结论】ARDRA方法在分子水平上为荧光假单胞菌的分离鉴定探索了一条新途径;TC222菌株具有拮抗多种植物病原真菌的能力,显示了良好的应用前景。

药用植物凤丹(Paeonia suffruticosa)根际土壤细菌群落16S rRNA基因的ARDRA分析

凤丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科多年生植物,是一种重要的传统中药资源。在其生长发育的周期中与土壤微生物尤其是根际土壤微生物有密切的关系。通过构建16S rRNA基因克隆文库及文库的限制性片段长度多态性分析(ARDRA),对中国药用植物凤丹5大主要分布区域的根际土壤细菌群落多样性进行了研究。采用限制性内切酶HinfI和Csp6I对克隆文库中随机挑选的1000个白色克隆子进行了酶切分型,根据酶切图谱的不同,将其分为324个OTUs,并对38个优势OTUs进行了测序和系统发育分析。16S rRNA基因序列分析结果表明,凤丹根际土壤细菌种群主要包括:变形菌门(包括alpha、beta、gamma、detla亚门)、酸杆菌门、放线菌门、拟杆菌门及厚壁菌门等11类细菌,此外还包含了3个未归类的细菌。变形菌门和酸杆菌门为文库中的主要菌群,分别占克隆总数的47.34%和14.36%,其中Pseudomonas sp.、Burkholderia sp.和Arthrobacter sp.为优势菌属。研究结果表明,我国药用植物凤丹5大主要分布区域的根际土壤细菌种群不仅具有丰富的多样性,还存在丰富的潜在新菌种。

采用ARDRA和RAPD对柳松菇(Agrocybe aegerita)菌株遗传多样性的分析

应用ARDRA(核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析 ,AmplifedRibosomalDNARestrictionAnalysis)和RAPD技术 ,对 7株来源于不同地域的柳松菇菌株之间的遗传多样性进行了分析。采用的两种分析方法均表明 :这 7株菌株存在着丰富的遗传多样性 ,从其遗传相似性来看 ,来源于希腊的Ag6、Ag8与来源于中国的Ag9、Ag10、Ag15、Ag2

滇池中芽孢杆菌的ARDRA分类及溶藻特性

针对从滇池中分离到的28株芽孢杆菌,用扩增rDNA限制性酶切片段分析法(ARDRA)进行了初步分类,共获得5个操作分类单元(OUT),其中OTU5为主要类型,包括14株细菌菌株.同时,以铜绿微囊藻和水华鱼腥藻为裂解对象,对该28株菌株的溶藻能力进行了测定,发现OTU5中有6株芽孢杆菌具有较好的溶藻能力,其培养液上清液具有强烈的溶藻作用,能在pH7、25℃的条件下抑制受试藻类的生长,可见,该6株芽孢杆菌应是通过分泌胞外物质而起溶藻作用的.

青藏铁路沿线唐古拉山口土壤微生物的ARDRA分析

通过构建16S rDNA文库及文库的限制性片段长度多态性分析(ARDRA),对青藏铁路沿线唐古拉山口的土壤微生物多样性进行了研究。采用限制性内切酶HaeIII和RsaI对克隆文库中的90个克隆子进行了酶切分型,根据ARDRA酶切图谱的不同,可将其分为23个OTUs。16SrDNA序列分析结果表明,该克隆文库中主要包括变形菌门(Proteobacteria)的alpha、beta、detla亚类、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)及浮霉菌门(Planctomycetes)等8类细菌及未培养细菌。Alpha变形细菌为该文库中的主要菌群,占克隆总数的33.3%;其次为未培养细菌,占克隆总数的22.2%,Bradyrhizobium为优势菌属。研究结果揭示,青藏铁路唐古拉山口的土壤微生物种群不仅具有丰富的多样性,还存在丰富的潜在新菌种。

应用ARDRA技术研究Frankia菌多样性

应用原核生物 16SrDNA特异性引物rD1和fD1,对分自 4个分类接种群的 12株纯培养Frankia菌总DNA进行扩增 ,得到 1条长约 15 0 0bp的扩增产物。选用 2种内切酶HinfI ,MspI对扩增产物进行酶切 ,得到稳定的酶切图谱。对图谱的分析结果表明 。

思茅松毛虫6龄幼虫肠道细菌的ARDRA分析与鉴定

从自然种群的思茅松毛虫(Dendrolimus kikuchii Matsumura)6龄幼虫肠道环境中分离、纯化、培养获得了6株细菌。以细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增,用2种双酶组合HaeⅢ和Hin dⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ对PCR产物进行核糖体DNA扩增片段限制性内切酶分析(ARDRA),得到了3个操作分类单元(OTUs)。对每个操作分类单元(OTU)的代表菌株进行16 S rDNA序列测定,序列分析结果表明,分离到的6株肠道细菌中,6N01、6N02、6N03、6N04和6N05属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.),6N06属于克雷伯氏杆菌属(Klebsiella sp.)。

微生物的ARDRA检测

ARDRA（扩增性rDNA限制性酶切片段分析）是新发展起来的一项生物检测技术，可在原位下获取其有关生物性状。本文阐述了ARDRA技术的原理和方法，介绍了该技术在微生物多样性和系统发育研究中的应用，并对ARDRA技术的应用前景提出展望。

3龄思茅松毛虫幼虫肠道好氧细菌的分离及ARDRA多态性分析

从3龄思茅松毛虫(Dendrolimus kikuchii)幼虫肠道样品中分离得到11株好氧细菌。以细菌基因组DNA为模板,扩增16 S rDNA,并用4种限制性内切酶HaeⅢ和HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ对PCR扩增产物进行ARDRA多态性分析。对聚类图谱的分析结果发现11株好氧细菌在70%的遗传相似度水平上聚成4个不同分类操作单元(OTU),表明3龄松毛虫中肠道内好氧细菌的遗传多样性水平偏低。

限制性片段长度多态性分析(ARDRA)方法对重金属污染土壤中细菌群落多样性的研究

限制性片段长度多态性分析(ARDRA)是用限制性内切酶消化扩增后的细菌16SrDNA,通过凝胶电泳分析微生物种群多样性的分子标记技术,该技术在微生物生态学领域有着广泛的应用.实验采用2种途径评价了这种方法应用于研究土壤中细菌种群多样性的可行性.通过对未污染土壤细菌16SrDNA的克隆,获得了经内切酶HaeⅢ消化的不同16SrDNA的ARDRA类型,并对测序的19个克隆子建立了系统发育树.此外,还对不同Cd和Pb污染水平的土壤微生物进行了群落水平上的ARDRA分析.结果表明,5mg·kg-1Cd和500mg·kg-1Pb污染对微生物群落组成有一定影响,但此范围内的重金属含量对微生物群落多样性没有相关性影响.

腾冲热海眼镜泉菌藻席细菌ARDRA指纹图谱分析

对腾冲热海眼镜泉中粉红色丝状菌藻席进行ARDRA指纹图谱分析,获得其细菌多样性的部分信息。直接提取菌藻席总DNA,以之为模板PCR扩增出细菌的16SrDNA,将其克隆、转化进入大肠杆菌,获得120个克隆子。用限制性内切酶(RsaⅠ、HhaⅠ、HapⅡ)筛选出了29个16SrDNA插入片段酶切带型差异明显的克隆,表明眼镜泉菌藻席细菌组成丰富。聚类分析显示这29个克隆聚为A、B两个大类,表明该菌藻席可能主要由两个遗传多样性丰富的分类群组成。

采用扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)研究双孢蘑菇培养料后发酵过程中的细菌群落结构(Ⅱ)-细菌群落结构ARDRA分析

采用ARDRA对双孢蘑菇[Agaricus bisporus(Large)Sing.]培养料后发酵过程中的细菌群落结构进行研究。细菌16S rDNA文库ARDRA分析结果表明,细菌群落在后发酵过程中发生了明显变化,4个时期文库的16S rDNA组成分别以各自独有酶切类型为主。ARDRA文库优势类群的序列分析结果显示,培养料中的细菌组成远多于传统分离方法所获得的类群:在"空气调节"时期培养料(C6)中发现了一些未曾报道的Bacilli门成员,如Trichococcus属、Planococcus属和Caryophanon属,以及γ-Proteobacteria亚纲;而在"后发酵"开始和结束的培养料(C1和C7)中分别检测到了Ther mus ther mophilus和α-Proteobacteria亚纲的细菌,这些是近年来利用分子生物学方法在高温堆肥中发现的新类群;同时,在整个"后发酵"过程中还发现了大量目前尚未获得培养的细菌类群。

黄瓜青枯病内生拮抗菌株的分离及ARDRA分析

在黄瓜生长的不同阶段从根系分离内生细菌共469株。通过青枯菌平板拮抗试验,从中筛选到具明显拮抗作用的菌株59株。将内生拮抗菌纯培养物扩增近全长的16SrDNA并用限制性内切酶AluⅠ对PCR产物进行ARDRA(amplifiedrDNArestrictionanalysis)多态性分析,共得到5种不同的操作分类单元(OperationalTaxonomicUnit,OTU)。其中属于OTU1共有39株分离物,占内生拮抗菌总数的66%,为优势种群。进一步通过ERIC-PCR指纹图的方法在菌株水平上分析OTU1类群。结果表明,OTU1可分为12种不同的菌株,其中菌株HE-1和HE-2在黄瓜生长的5个不同阶段均可分离到。通过标记天然不具有利福平抗性的HE-1和HE-2菌株,获得抗利福平突变体菌株,回收检测结果表明,在栽培的不同时期,黄瓜植株根内均有HE-1和HE-2菌株的定殖。经防病效果的盆栽试验,发现HE-1和HE-2的浸种处理能有效降低黄瓜青枯病的病发率,与对照比较差异显著。因此确定HE-1和HE-2为黄瓜青枯病生物防治的优良菌株。

工业废水中降酚菌的分离及ARDRA多态性分析

分别将炼油废水、印染废水、造纸废水样品倍比稀释后涂布平板分离菌株,用苯酚羟化酶基因特异引物检测苯酚降解菌,共分离得到87株降酚菌。经ER IC-PCR指纹图分析,显示15种不同的类型。进一步对显示不同ER IC-PCR指纹图的15种分离物的代表菌株进行ARDRA多态性分析,结果可分为4个OTUs(Operational Taxonom ic Un it,OTU),表明实验分离得到的降酚菌至少存在4个不同的种(spec ies)。

疣蝗肠道好氧细菌的分离及ARDRA多态性分析

将疣蝗中肠样品倍比稀释后涂布平板分离菌株,共分离得到11株好氧细菌。以细菌基因组DNA为模板,用细菌16SrDNA通用引物(27f,1492r)对模板扩增,并用4种限制性内切酶HaeⅢ和HindⅢ、HinfⅠ和TaqⅠ对PCR扩增产物进行ARDRA多态性分析。对聚类图谱的分析结果发现,11株好氧细菌在82%的水平上聚成3个不同分类操作单元(OTU),表明疣蝗肠道内好氧细菌的遗传多样性水平偏低。

ARDRA技术快速鉴别四种致病曲霉的实验研究

目的:建立检测侵袭性曲霉感染病原菌ARDRA方法。方法:用烟曲霉、黄曲霉、土曲霉和黑曲霉的标准株建立PCR技术和RFLP技术相结合的扩增rDNA限制性分析(ARDRA)方法,然后对16株临床株进行ARDRA分析。结果:ARDRA技术可以较好地鉴别引起侵袭性曲霉感染的四种常见菌种,从DNA提取到酶切分析结束可以在一个工作日中完成;16株临床株酶切图谱与对应标准株图谱相同。结论:ARDRA技术是一种能够快速鉴别侵袭性曲霉感染病原菌的有效方法。

两种苯甲酸处理系统细菌群落结构的ARDRA分析

利用ARDRA(扩增rDNA限制性分析)的方法对两种驯化条件产生的苯甲酸活性污泥中细菌的群落结构进行了分析。提取污泥样品总DNA以后,利用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增。结果显示:两种活性污泥分别有20.4%和24.3%的酶切类型是自身特有的,可见在微生物群落结构上差别显著。并且利用这种方法分别检测到了103和107种的微生物类型,而利用传统的纯培养手段则只分别分离到了7种和8种微生物,分别只占ARDRA方法的6.8%和7.5%,充分显示了分子生物学的方法在进行微生物群落结构研究方面所具有的优越性。

利用核糖体DNA限制性酶切谱(ARDRA)分子技术和小亚基单位核糖体RNA(SSrRNA)基因序列分析对五种双眉虫(原生动物,纤毛门,游仆目)种内及种间关系的探讨

从12种限制性内切酶中筛选出6种可获得种间多样性的内切酶:Alu Ⅰ,Taq Ⅰ,Hae Ⅲ,Hinf Ⅰ,Msp Ⅰ,Xba Ⅰ,对广义双眉虫Diophrys-complex5个种(伪寡毛双眉虫Diophrys apoligothrix、悬游双眉虫D.appendiculata、盾圆双眉虫D.scutum、秀丽拟双眉虫Paradiophrys irmgard、针毛类双眉虫Diophryopsis hystrix)共7个种群的核糖体基因(18S小亚基、部分23S大亚基及其内转录间隔区域)进行多位点酶切。结果显示,种间差异明显大于种内差异。利用RAPDistance1.04软件构建的邻接树表明,盾圆双眉虫的3个种群表现出高度的同源性;3个近缘属(双眉虫属、拟双眉虫属、类双眉虫属)可以被明确区分,并支持类双眉虫属与拟双眉虫属的独立性。从GenBank/EMBL数据库中获得广义双眉虫及相近种的小亚基单位核糖体RNA(SSrRNA)基因序列,利用邻接法(NJ),贝叶斯法(Bayesian)和最大简约法(MP)构建的系统发生树具有基本一致的拓扑结构,结果显示:狭义双眉虫属Diophrys为单源发生系,并与类双眉虫属Diophryopsis组成姐妹群;尽管拟双眉虫属Paradiophrys具有广义双眉虫典型的形态学特征,但与尾刺虫属Uronychia有着较近的亲缘关系。本工作同时表明,核糖体DNA限制性酶切(ARDRA)技术可靠地区分纤毛虫的形态相似种,并在双眉虫属间水平的系统关系推定中存在一定的适用性。