马兜铃酪氨酸脱羧酶基因克隆、测序及同源性分析

[目的]从中草药马兜铃中获得酪氨酸脱羧酶基因(tyrDC)互补DNA(cDNA)序列并进行同源性分析,以进一步达 到敲除tyrDC,减轻该药肾毒性的目的。[方法]参照已知的植物酪氨酸脱羧酶的保守性氨基酸序列设计简并引物,并通过 反转录聚合酶链反应(RT-PCR)从马兜铃中扩增出cDNA片段。将扩增的cDNA序列克隆并测序,用以设计特异引物,并 通过cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)从马兜铃中扩增出全长tyrDC cDNA。[结果]该克隆的 tyrDC cDNA的总长度为1 678 bp,包括一个编码516个氨基酸的1 551bp开读框(ORF)和一段127 bp的下游非翻译区 (3'UTR)。序列比较结果表明,由马兜铃tyrDC核苷酸序列推导的氨基酸序列分别与已发布的罂粟酪氨酸脱羧酶和唐松草酪 氨酸／多巴脱羧酶享有76％和79％的同源性。[结论]从马兜铃中扩增得到tyrDC cDNA全序列,且对酪氨酸脱羧酶的同源检 索显示,不同植物的酪氨酸脱羧酶之间都存在普遍的序列相似性。为去除马兜铃肾毒性奠定了基础。

马兜铃的组织培养与植株再生

探讨马兜铃经组织培养再生植株的条件。【方法】以马兜铃叶片作为外植体,以1／2MS、MS和改良MS培养基为基本培养基,在这些基本培养基上分别添加相应的植物激素而成为诱导马兜铃愈伤组织的培养基,观察:①3种基本培养基对诱导马兜铃愈伤组织的优劣;②不同pH值环境对诱导马兜铃愈伤组织的影响;③在相同的基本培养基中分别或同时加入不同种和不同量的植物激素(包括细胞分裂素KT或6-BA和生长激素NAA)后,对诱导马兜铃愈伤组织的影响。【结果】①在3种基本培养基中加入相同的植物激素(0．1mg／L的KT和0．2mg／L的NAA)后,MS和改良MS培养基均能诱导大量的愈伤组织,而1／2MS培养基则未能诱导;②相同的培养基(改良MS培养基加入0．1 mg／L的KT和0．2 mg／L的 NAA)分别置于pH=5.8、pH=7．0、pH=8．0的环境中时,后两者均能诱导大量的愈伤组织,而前者则只能诱导很少量的愈伤组织;③在相同的基本培养基(改良MS培养基)中分别单独加入细胞分裂素和单独加入生长激素,前者未见诱导出愈伤组织,而后者能诱导出来;将不同种和不同量的植物激素组成各种组合加入到相同的基本培养基(改良MS培养基) 中,所形成的各种培养基对诱导马兜铃愈伤组织的影响观察显示,加入生长激素过多时,细胞分裂过快,导致愈伤组织松散而不利于芽的分化,加入过少时愈伤组织诱导率不高;最佳的培养基组合是在改良MS培养基中加入1 mg/L KT、0．5 mg／L NAA的培养基。【结论】以MS或改良MS为基本培养基,并在此基础上添加1 mg/L的KT和0．5 mg／L的NAA组成诱导愈伤组织的培养基,在pH=7．0～8．0的碱性环境下培养,是马兜铃经组织培养能较好地诱导愈伤组织的条件。