小G蛋白ARL3多克隆抗体制备及其突变体鉴定

为探究ARL3在纤毛生成和纤毛信号转导中的功能,制备了兔抗莱茵衣藻ARL3多克隆抗体,并鉴定了arl3突变体。通过基因克隆获取arl3目的基因,构建原核表达载体pET-28a(+)-arl3,以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主表达融合蛋白6×His-ARL3。将纯化后的目的蛋白质用于免疫兔子并获得抗血清,随后对抗血清中的protein A和抗原抗体进行纯化,并通过蛋白质免疫印迹检测莱茵衣藻ARL3抗原。结果表明,抗血清效价可达1∶102400,纯化后的ARL3抗体在1∶400的稀释条件下检测出单一目的条带。表明作者成功制备了高特异性、高灵敏度的兔抗莱茵衣藻ARL3蛋白多克隆抗体,且鉴定出一株arl3突变体,为进一步研究莱茵衣藻ARL3蛋白在纤毛内的功能提供了基础。

东北狍ARL3基因cDNA克隆及序列分析

为了研究ARL3基因的结构及其编码蛋白的理化性质,从而进一步推测该基因的功能,试验采用基因克隆技术成功获得东北狍(Capreolus pygargus)ARL3基因包含全部编码区的cDNA序列,并利用生物信息学方法对东北狍ARL3基因核苷酸及其编码氨基酸序列的结构特征进行初步预测和分析,并基于ARL3蛋白的氨基酸序列构建了分子系统进化树。结果表明:ARL3基因开放阅读框(ORF)为549 bp,共编码了182个氨基酸。ARL3蛋白具有亲水的特性,不存在信号肽,其二级结构主要由无规则卷曲组成,其次是α-螺旋和延伸链,分别占46.15%、33.52%和20.33%。ARL3蛋白有一个与P-loop;TPase超家族相似度很高的ARL3活性蛋白区域。生物信息学分析发现东北狍ARL3基因在进化上较为保守,构建的进化树表明东北狍与白尾鹿、野耗牛等物种亲缘关系较近。