苯丙氨酸合成的关键酶基因aroG与pheA串联表达

ａｒｏＧ 和ｐｈｅＡ 是与苯丙氨酸合成有关的两个重要基因。在大肠杆菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） 中，ａｒｏＧ 基因编码脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶（ＤＳ） ，该酶催化由糖代谢中心途径分流出来的磷酸烯醇丙酮酸（ＰＥＰ） 和赤鲜糖４磷酸（Ｅ４Ｐ） 缩合形成脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸（ＤＡＨＰ） 的反应；ｐｈｅＡ 基因编码一个双功能酶蛋白，它同时催化两步关键反应，即具有分枝酸变位酶（ＣＭ） 和预苯酸脱水（ＰＤ） 的两种功能。采用ＰＣＲ 技术分别从两个不同品系的大肠杆菌染色体ＤＮＡ 中扩增到ａｒｏＧ 和ｐｈｅＡ。当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌Ｐ２３９２ 中进行表达时，它们编码的酶ＤＳ、ＣＭ 和ＰＤ 活性分别提高４－３ 、４－４ 和２－２ 倍；导入短杆菌（ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２７３１ 中表达时，相应的酶活性分别提高１２－３ 、２－３ 和５－６ 倍。两基因的串联表达能大幅度地提高工程菌株的苯丙氨酸发酵产量。

外源基因pheA、aroG和tyrB在苯丙氨酸合成途径中的共表达

利用基因工程技术提高了短杆菌的苯丙氨酸合成途径中关键酶活性 ,大幅度地增加了生物合成苯丙氨酸的产量。首先采用聚合酶链反应 (PCR)从大肠杆菌的氟代苯丙氨酸抗性变异菌株基因组中扩增到与苯丙氨酸合成相关的aroG ,pheA和tyrB 3个基因。其中aroG编码 3 脱氧 2 阿拉伯庚酮糖 7 磷酸合成酶 (DS) ,pheA编码双功能酶蛋白 分枝酸变位酶 (CM)和预苯酸脱水酶 (PD) ,tyrB编码转氨酶 (AT)。设计不同的酶切位点 ,利用质粒pUC118的多克隆位点 ,将 3个基因按不同的顺序组合串联 ,然后插入穿梭质粒pCZ 10 ,导入短杆菌中表达。结果表明 3个大肠杆菌基因在短杆菌中能够表达。其中以aroG pheA tyrB顺序串联而构建的黄色短杆菌工程菌株1311 GAB中的DS酶活力提高 4 5倍 ,CM提高 4 2倍 ,PD提高 2 7倍 ,AT提高 3 2倍 ;它的苯丙氨酸合成量提高2 35倍。

大肠杆菌aroG基因的定点突变及与trpBA基因的串联表达

为了提高大肠杆菌生产色氨酸的产量,以大肠杆菌中aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPS)与trpBA基因编码的色氨酸合成酶(TSase)两个关键酶为研究对象,利用SOE-PCR方法对aroG基因进行632位碱基定点突变,获得抗反馈抑制的定点突变aroGf br基因,并与扩增获得trpBA基因串联于pEtac表达载体上共表达,获得重组菌Escherichia coli JM109/pEtac-aroGfbr-tac-trpBA,同时构建对照菌株E.coli JM109/pEtac-aroG-tac-trpBA.两种串联表达质粒重组菌的DAHPS酶活性,分别比含空载体出发菌株相应酶的活性提高4.3倍和3.8倍,突变DAHPS酶活提高1.13倍.摇瓶发酵表明,所构建的两菌株与出发菌株色氨酸产量相比较,分别提高8.23倍和11.47倍,带突变aroGf br基因的菌株比对照菌株色氨酸产量提高1.4倍,色氨酸产量明显提高,说明突变菌株能有效解除苯丙氨酸的反馈抑制作用.

利用DNA shuffling构建部分解除对氟苯丙氨酸反馈抑制的aroG

3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(DAHPs)是芳香族氨基酸生物合成途径中关键的限速酶,在大肠杆菌中有3种同工酶,分别由aroG(Phe)、aroH(Trp)和aroF(Tyr)基因编码,这3种酶分别受苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,以Escherichia coli野生型aroG、aroH和aroF基因为亲本,通过DNAshuffling技术对aroG基因进行改组,将获得的改组aroG与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得2个能耐受10 mg/mLp-FP的克隆.这2个克隆的测序结果显示,其中一个发生了3个点突变:C129T,A531G,A1032G;另一个发生了3个点突变T77A,G883A,A1032G和4个碱基的插入突变即922位插入A,943位插入CG,971位插入A.2个改组AroG的最适pH和最适温度与野生型AroG相比无明显变化.

通过DNA shuffling技术获得初步解除苯丙氨酸反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(AroG)突变株

aroG基因编码的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate synthase,AroG)是苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)合成途径中的关键酶之一,受到苯丙氨酸的反馈抑制.为得到解除苯丙氨酸反馈抑制的突变AroG,分别以Escherichia coli(E.coli)野生型和突变型aroG基因以及Sal monella typhi mnrium(S.typhi mnrium)野生型aroG基因为亲本,通过DNA suffling技术对aroG进行改组,获得的改组分子与载体pET30a连接得到改组文库,转化到E.coliBL21(DE3)中,在含有Phe类似物对氟苯丙氨酸(p-FP)的培养基上筛选转化子,获得4个解除Phe反馈抑制的克隆.

大肠杆菌aroG基因在枯草杆菌中的分泌表达

为了对大肠杆菌中由aroG基因编码的 3 脱氧 D 阿拉伯庚酮糖酸 7 磷酸合成酶 (DAHP合成酶 )进行结构与功能的深入研究 ,尝试了aroG基因在枯草杆菌中的表达 .表达载体以pUB110为骨架 ,采用了枯草杆菌热激蛋白 groESL基因的启动子 ,碱性蛋白酶subtilisin基因的信号肽和N 乙酰胞壁酸 L 丙氨酸酰胺酶cwlB基因的转录终止子 ,将aroG基因在枯草杆菌WB6 0 0宿主菌中进行了分泌表达 .在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上可以明显看到与aroG基因表达产物分子质量一致的蛋白条带 ,并在培养基中可以检测到DAHP合成酶的活性 .

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控研究

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量,对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造。首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控,进而又敲除了tnaA基因,阻断了色氨酸的分解代谢。然后,将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达,以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈。与对照MG1655相比,trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍,双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍。pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168mg/L,而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后,色氨酸浓度提高到820mg/L。为构建色氨酸高产菌奠定了基础。

正体与斜体使用规则

物种的学名属名、种名（包括亚种、变种）用拉丁文斜体,首字母大写,其余小写;属以上用拉丁文正体,首字母大写。限制性内切酶前3个字母用斜体,后面的字母和编码正体平排,例如：BamHⅠ、EcoRⅠ、MspⅠ、Sau3AⅠ等。氨基酸和碱基的缩写氨基酸缩写用3个字母表示时,仅第一个字母大写,其余小写,正体。碱基缩写为大写正体。基因及表型产物的符号表示基因座名的英文缩写用斜体,一般为小写字母,如：sch。基因位点用正体大写,突变或等位基因的符号或数字用正体,如：大肠杆菌aroG基因、突变基因argSΔr245。基因表型产物符号用正体。