吴茱萸碱对H_(2)O_(2)诱导ARPE-19细胞的炎症反应、细胞凋亡和SIRT1表达的影响

目的 探究吴茱萸碱对H_(2)O_(2)刺激下人视网膜色素上皮细胞ARPE-19的炎症反应和细胞凋亡的影响,阐明去乙酰化酶1(SIRT1)在其中的作用和相关机制。方法 分别采用不同浓度的H_(2)O_(2)(0,25,50,100,200,400μmol/L)和不同浓度的吴茱萸碱(0,2.5,5.0,10.0,20.0,40.0μmol/L)处理ARPE-19细胞,CCK-8法筛选H_(2)O_(2)和吴茱萸碱的最佳作用浓度。使用H_(2)O_(2)(200μmol/L)与不同浓度的吴茱萸碱(2.5,5,10,20μmol/L)联合处理ARPE-19细胞,Western blot法检测细胞中SIRT1蛋白表达情况。按处理方式的不同将ARPE-19细胞分为二甲基亚砜处理的对照组、200μmol/L H_(2)O_(2)处理组(H_(2)O_(2)组)、200μmol/L H_(2)O_(2)与不同浓度吴茱萸碱处理组(H_(2)O_(2)+吴茱萸碱10μmol/L组、H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组)及100μmol/L的SIRT1抑制剂Sirtinol拮抗组(H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L+Sirtinol组),处理24 h后,ELISA法检测各组ARPE-19细胞上清液中炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)水平,Annexin V-FITC/PI染色检测各组ARPE-19细胞的凋亡率,Western blot法检测各组ARPE-19细胞中核因子-κB p65(NF-κB p65)、环氧化酶-2(COX-2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、裂解型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、Caspase-3、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达情况。结果 200μmol/L的H_(2)O_(2)对ARPE-19细胞的生长抑制相对稳定。0,2.5,5.0,10.0,20.0μmol/L的吴茱萸碱对ARPE-19细胞活力无明显影响(P均>0.05),40μmol/L吴茱萸碱可明显降低ARPE-19细胞活力(P均<0.05)。H_(2)O_(2)组和H_(2)O_(2)+吴茱萸碱各组ARPE-19细胞中SIRT1蛋白相对表达量均明显低于对照组(P均<0.05);H_(2)O_(2)+吴茱萸碱5μmol/L组、H_(2)O_(2)+吴茱萸碱10μmol/L组和H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组中SIRT1蛋白相对表达量均明显高于H_(2)O_(2)组(P均<0.05),且H_(2)O_(2)+吴茱萸碱10μmol/L组和H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组升高更明显。与对照组比较,H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+吴茱萸碱10μmol/L组、H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组和H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L+Sirtinol组细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6水平和COX-2、NF-κB p65、Bax蛋白相对表达量及Cleaved Caspase-3/Caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均明显升高(P均<0.05), Bcl-2蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,H_(2)O_(2)+吴茱萸碱10μmol/L组、H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组中TNF-α、IL-1β、IL-6水平和COX-2、NF-κB p65、Bax蛋白相对表达量及Cleaved Caspase-3/Caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均明显降低(P均<0.05),Bcl-2蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L+Sirtinol组中TNF-α、IL-1β、IL-6水平和COX-2、NF-κB p65、Bax蛋白相对表达量及Cleaved Caspase-3/Caspase-3、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值均明显高于H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组(P均<0.05), Bcl-2蛋白相对表达量明显低于H_(2)O_(2)+吴茱萸碱20μmol/L组(P<0.05),各指标与H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+吴茱萸碱10μmol/L组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 吴茱萸碱可在体外通过上调SIRT1表达来抑制NF-κB通路、线粒体介导的凋亡通路和PI3K/Akt通路,从而减轻H_(2)O_(2)刺激下ARPE-19细胞的炎症反应,减少细胞凋亡。

基于PERK/ATF4/CHOP信号通路研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导的ARPE-19细胞的作用机制

目的研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导ARPE-19细胞的影响及其可能机制。方法构建细胞内质网应激损伤模型,将ARPE-19细胞分为空白组、模型组、空白血清组、滋阴明目方含药血清组、牛磺熊去氧胆酸组。对细胞进行形态观察,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白的表达。结果选用浓度50μmol/L衣霉素干预ARPE-19细胞造模。观察细胞形态发现,滋阴明目方含药血清组和牛磺熊去氧胆酸组ARPE-19细胞较模型组细胞数量增多,生长较均匀,漂浮的死亡ARPE-19细胞及碎片减少。与空白组相比,模型组和空白血清组的细胞存活率下降(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达上调(P<0.01)。与模型组相比,滋阴明目方含药血清组细胞存活率上升(P<0.01),凋亡率明显下降(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达下调(P<0.01)。结论滋阴明目方含药血清可以减少ARPE-19细胞内质网应激损伤模型的凋亡,其分子机制与调控PERK-ATF4-CHOP信号通路有关。

GLS1通过激活Nrf2/HO-1轴抑制过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡

目的探究GLS1对过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡的影响及机制。方法ARPE-19细胞分为对照组、H_(2)O_(2)组、H_(2)O_(2)+Vector组、H_(2)O_(2)+GLS1组,对照组细胞不做任何处理,H_(2)O_(2)组细胞用200μmol/L H_(2)O_(2)诱导48h,H_(2)O_(2)+Vector组和H_(2)O_(2)+GLS1组细胞转染Vector和GLS1质粒后用200μmol/L H_(2)O_(2)诱导48 h,比色法测定各组细胞SOD、GSH和MDA浓度,透射电镜观察各组细胞自噬小体,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,Western blot检测各组细胞Nrf2、HO-1、LC3-Ⅱ、p62的表达。结果与对照组比较,H_(2)O_(2)组ARPE-19细胞SOD、GSH表达显著下降,MDA显著增加,自噬小体数目显著增加,细胞凋亡显著增加,LC3-Ⅱ表达显著上调,P62、抗核因子红系2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧合酶1(heme Oxygenase-1,HO-1)表达显著下调。与H_(2)O_(2)+Vector组比较,H_(2)O_(2)+GLS1组细胞SOD、GSH表达显著增加,MDA显著降低,自噬小体数目显著减少,细胞凋亡显著减少,LC3-Ⅱ表达显著下调,P62、Nrf2、HO-1表达显著上调。结论GLS1可抑制H_(2)O_(2)诱导的ARPE-19细胞氧化应激、自噬与凋亡,其机制为激活Nrf2/HO-1信号通路。

448 nm蓝光照射致ARPE-19细胞坏死性凋亡研究

长期超风险限值蓝光照射可能导致视网膜变性疾病,而视网膜色素上皮损伤是视网膜光损伤的关键来源。本研究探讨了448 nm蓝光对人视网膜色素上皮细胞的损伤作用及凋亡方式。25 mW/cm2蓝光照射ARPE-19细胞3、6、9、12 h,照后即刻采用钙黄绿素乙酰甲酯染色检测细胞活性,并在照后24 h采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测坏死性凋亡相关基因表达,同时采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测坏死性凋亡和DNA损伤标志蛋白表达。9 h和12 h照射组细胞形态发生显著变化,表现为细胞肿胀、间隙增大、漂浮细胞增多、细胞碎片增加;蓝光照射3~9 h后RIPK1、RIPK3 mRNA表达量较正常组出现明显升高,且在照射9 h时达到最大值;蓝光照射6~12 h后RIPK1、RIPK3、P-MLKL坏死性凋亡蛋白标志物的表达量随蓝光照射时间增加而明显升高,并在照射12 h时达到最高值;蓝光照射3~12 h后DNA损伤标志物γ-H2AX蛋白表达量明显升高,并在照射12 h时达到最高值。蓝光照射9 h坏死性凋亡相关基因表达量达到最大,照射12 h基因表达明显下降但坏死性凋亡相关蛋白表达量累积到最大,这提示25 mW/cm2蓝光照射9~12 h可诱导ARPE-19细胞发生坏死性凋亡,并表明DNA损伤程度与细胞坏死性凋亡发生可能存在关联。

α-硫辛酸对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用

目的 研究α-硫辛酸(ALA)对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用。方法 体外培养ARPE-19细胞,随机分为正常组(N组)、药物组(D组)、光照组(L组)、药物+光照组(D+L组)。倒置显微镜下观察ARPE-19细胞形态结构。CCK-8法检测各组ARPE-19细胞活性;流式细胞仪(Annexin V/PI双染色法)检测ARPE-19细胞凋亡率;倒置荧光显微镜检测ARPE-19细胞ROS水平;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ARPE-19细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1) mRNA表达水平;Western blot检测ARPE-19细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Nrf2、NQO1蛋白表达水平。结果 N组及D组细胞均呈贴壁生长,分布均匀,形态清晰,细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与N组相比,L组细胞皱缩、变小、变圆,失去正常形态,部分细胞不能贴壁生长,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,ROS水平升高(均为P<0.05);与L组相比,D+L组细胞形态改善,大部分细胞呈梭形贴壁生长,细胞轮廓较清晰,小部分细胞失去正常形态结构,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,ROS水平降低(均为P<0.05)。RT-qPCR检测结果显示:与N组相比,L组细胞NQO-1、HO-1的mRNA相对表达量均升高(均为P<0.05),Nrf2、GST的mRNA相对表达量均升高,但差异均无统计学意义(均为P>0.05);与L组相比,D+L组细胞Nrf2、GST、NQO-1、HO-1的mRNA相对表达量均升高(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示:与N组相比,L组细胞的Caspase-3、Nrf2蛋白相对表达量均升高(均为P<0.05);与L组相比,D+L组细胞的Caspase-3蛋白相对表达量降低(P<0.05),Nrf2、NQO-1蛋白相对表达量均升高(均为P<0.05)。结论 蓝光会导致ARPEA-19细胞产生氧化应激损伤并最终导致细胞凋亡,而ALA能够增强ARPE-19细胞对蓝光损伤的抗氧化保护作用。

硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的利用丙烯醛建立年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的细胞损伤模型,并观察硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导ARPE-19细胞损伤的保护作用。方法 MTT比色法检测ARPE-19细胞的生长周期。将25μmol·L-1、50μmol·L-1、100μmol·L-1丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24h,复制AMD细胞水平的损伤模型并确定其损伤浓度;预先加入50μmol·L-1、100μmol·L-1、150μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体及150μmol·L-1硫辛酸预处理对数生长期细胞24h后,再加入已经确定细胞损伤模型的丙烯醛浓度处理24h,前后两次处理后均用MTT比色法检测细胞活性,HE染色法检测细胞数量和形态改变。结果 ARPE-19细胞24h内开始贴壁,4～5d细胞生长开始融合,第1-6天后生长分裂迅速进入对数生长期,6d后即开始随着时间延长活性显著下降。当丙烯醛浓度达到50μmol·L-1时,ARPE-19细胞数量明显减少,细胞肿胀、坏死,胞浆收缩、细胞核聚集;而当硫辛酸烟酸二联体浓度达到100μmol·L-1时即可以明显减少50μmol·L-1丙烯醛诱导的ARPE-19细胞活性的降低,防止凋亡小体的形成。MTT结果显示:100μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体+丙烯醛处理组(50μmol·L-1)抗凋亡效果优于100μmol·L-1硫辛酸组,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论利用丙烯醛可以诱导ARPE-19细胞损伤来建立AMD细胞损伤的模型,硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤具有保护作用。

金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响

目的:研究低氧对体外培养的人ARPE-19细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响。方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示bFGF的表达,半定量分析低氧处理不同时间对体外培养的ARPE-19细胞bFGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧诱导的bFGF表达的影响。结果:对照组有低水平bFGF蛋白的表达,随着低氧处理时间的延长,荧光比值在1h达到高峰。Gen(50,100,200μmol/L组)与二甲基亚砜(DM-SO)对照组相比,均可明显抑制低氧诱导的bFGF的表达,且这种抑制作用呈浓度依赖性。结论:Gen可抑制低氧诱导的ARPE-19细胞bFGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值。

补肾养血明目方含药肠吸收液对ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨补肾养血明目方含药肠吸收液对氢醌(hydroquinone,HQ)诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)氧化应激损伤的保护作用。方法:采用不同浓度HQ诱导体外培养ARPE-19细胞氧化损伤,确定最佳造模浓度;制备补肾养血明目方含药肠吸收液。采用CCK-8法检测补肾养血明目方含药肠吸收液对ARPE-19细胞活力的影响,TUNEL技术观察其对细胞凋亡的保护作用,以及化学比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性。结果:当HQ浓度达到90μmol/L以上时,ARPE-19细胞活性明显降低。相较于模型组,预防给药时,浓度1%和2%补肾养血明目方含药肠吸收液对HQ损伤具有有显著保护作用(均P<0.01),0.5%和5%含药肠吸收液对HQ损伤有一定保护作用(均P<0.05);治疗给药时,1%和2%含药肠吸收液对HQ损伤有一定保护作用(均P<0.05)。与模型组相比,预防组的细胞凋亡率显著下降(P<0.01),治疗组的细胞凋亡率有一定下降(P<0.05)。抗氧化酶检测结果显示与模型组相比,预防组和治疗组均能明显提高SOD和GSH-Px含量(均P<0.05),其中预防组的作用更为显著(P<0.01,P<0.05)。结论:补肾养血明目方对HQ诱导的ARPE-19细胞氧化损伤有保护作用,其作用机制可能与增加细胞内抗氧化酶的含量有关。

CCK-8法检测蓝光和白光对ARPE-19细胞增殖的影响

目的:探讨蓝光和白光分别光照不同时间对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞增殖的影响,为进一步检测光照损伤过程中相关因子的变化情况,研究光照损伤过程中的信号转导机制奠定基础。方法:收集生长状态良好的ARPE-19细胞进行实验,制作CCK-8标准曲线,确定实验合适的ARPE-19细胞密度及CCK-8试剂的反应时间。将细胞分为避光组、蓝光组、白光组,分别光照3、6、9h,再避光培养12h后采用CCK-8法检测不同光源光照不同时间对ARPE-19细胞增殖率的影响。结果:通过CCK-8标准曲线选择每孔细胞数量为20000个,CCK-8溶液作用4h后测量相应吸光度值。CCK-8检测结果示,避光组、蓝光组、白光组三组细胞光照不同时间细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.01)。蓝光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.001),且随着光照时间的延长,细胞增殖率逐渐降低。白光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中光照3h和6h细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),而光照9h分别与光照3、6h细胞增殖率比较,差异均无统计学意义(P=0.253、0.120)。白光光照3～6h细胞增殖率呈下降趋势,而光照6～9h细胞增殖率呈现上升趋势。相同光照时间,蓝光组和白光组细胞增殖率均低于避光组,且蓝光组细胞增殖率均低于白光组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:光照能抑制ARPE-19细胞的增殖,其中蓝光光照细胞增殖率明显低于白光,且随光照时间的增长,细胞增殖率进一步降低。

H2O2诱导ARPE-19细胞损伤模型的建立及蓝莓花青素的保护作用

目的建立H_2O_2诱导视网膜色素上皮细胞ARPE^(-1)9(acute retinal pigment epithelial^(-1)9)细胞损伤模型,研究蓝莓花青素对细胞的保护作用。方法采用MTT法测定细胞存活率,免疫荧光法测定细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。以浓度0~3 200μmol·L^(-1)的H_2O_2为诱导剂,刺激细胞2、6、24 h,用1、5、10 mg·L^(-1)花青素提取物(blueberry anthocyanin extract,BAE)预处理细胞6、24 h,比较对细胞的保护作用,确定H_2O_2的浓度及诱导时间。通过ARPE^(-1)9细胞损伤模型的建立,研究蓝莓花青素对细胞的保护作用。结果以800μmol·L^(-1)H_2O_2刺激2 h为条件,建立ARPE^(-1)9细胞损伤模型,细胞存活率为63.69%。5 mg·L^(-1)蓝莓花青素提取物、锦葵色素(malvidin,Mv)及其葡萄糖苷(malvidin-3-glucoside,Mv-3-glc)和半乳糖苷(malvidin-3-galactoside,Mv-3-gal)预处理6 h后,细胞存活率明显提高(P<0.01),分别达到86.57%、115.72%、98.15%、127.97%;细胞中ROS水平明显下降(P<0.05),依次减少52.38%、95.38%、77.55%、116.09%。结论蓝莓花青素可以有效抑制H_2O_2诱导产生的视网膜细胞氧化损伤,其中主成分锦葵色素及其糖苷发挥重要作用。

硫辛酸烟酸二联体拮抗丙烯醛诱导ARPE-19细胞凋亡的作用机制

目的:探讨Bax、Bcl-2蛋白在硫辛酸烟酸二联体拮抗丙烯醛诱导的体外培养ARPE-19细胞凋亡中可能的调控作用。方法:ARPE-19细胞置于含有10%体积分数胎牛血清的DMEM培养基,37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,待培养瓶底部ARPE-19细胞长至70%时,种6孔板,用不含血清的DMEM培养基培养24 h,细胞换液。实验分为3组:空白对照组、丙烯醛组和硫辛酸烟酸二联体组。细胞流式检测各组ARPE-19细胞凋亡情况,Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达水平。结果:细胞流式显示正常细胞在空白对照组中为94.8%,丙烯醛组中为60.98%,硫辛酸烟酸二联体组中为91.34%。Western Blot显示空白对照组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为0.293 9,丙烯醛组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为1.389 2,硫辛酸烟酸二联体组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为0.555 8。结论:硫辛酸烟酸二联体对ARPE-19细胞的保护作用机制是通过激活抗凋亡蛋白Bcl-2来抑制凋亡蛋白Bax的表达。

补肾养血明目方对丙烯醛致ARPE-19细胞氧化应激的干预作用

目的:利用丙烯醛建立ARPE-19细胞氧化应激模型,观察补肾养血明目方含药血清对丙烯醛诱导ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用。方法:制备SD大鼠补肾养血明目方含药血清及空白血清,通过CCK-8检测不同浓度(2.5%,5%,10%,20%,40%)血清对细胞活性的影响,预先加入1.25%,2.5%,5%等不同浓度的含药血清处理24h后,将终浓度为75μmol/L的丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24h,CCK-8法检测含药血清对细胞活力的影响,DAPI染色观察细胞核形态。结果:CCK-8结果示:低浓度(2.5%,5%)血清对细胞活性影响不大(P>0.05),高浓度(10%,20%,40%)血清降低细胞活性(P<0.05),补肾养血明目方含药血清中、高剂量组细胞活性较空白血清组有统计学意义(P<0.05);结论:补肾养血明目方对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤有保护作用。

金雀异黄素对缺氧诱导的ARPE-19细胞中VEGF表达的影响

目的研究长期缺氧对体外培养的人ARPE-19细胞血管内皮生长因子(vascular endotheial growth factor,VEGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响和机理。方法使用半定量RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ARPE-19细胞中VEGFmRNA和蛋白的表达,分析不同浓度Gen以及PD98059、TyrphostinA25对ARPE-19细胞缺氧24h诱导的VEGF表达的影响。结果(1)正常对照组有少量VEGF表达,缺氧24h可明显提高ARPE-19细胞VEGFmRNA和蛋白的表达,分别为(9.566±1.528)倍和(2.636±0.499)倍;(2)Gen(50μmol·L-1,100μmol·L-1,200μmol·L-1)与缺氧组对比,分别抑制缺氧组VEGFmRNA表达的55.03%、78.72%、90.69%,蛋白的表达量为(189.60±20.20)ng·L-1(117.70±21.97)ng·L-1、(49.70±13.17)ng·L-1,抑制作用呈浓度依赖性;(3)PD98059、TyrphostinA25也可抑制缺氧诱导的VEGFmRNA表达的67.24%和56.25%,蛋白表达量为(86.33±12.47)ng·L-1、(98.08±2.42)ng·L-1。结论Gen可抑制长期缺氧诱导的ARPE-19细胞VEGF表达,并可能是通过抑制p42/p44MAPK途径和HIF-1途径共同抑制VEGF的表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有预防和潜在的治疗价值。

Bax、Bcl-2在丙烯醛诱导的ARPE-19细胞凋亡中的作用

目的观察Bax、Bcl-2蛋白在丙烯醛诱导的体外培养ARPE-19细胞凋亡中的作用。方法将培养的ARPE-19细胞置于含有体积分数10%胎牛血清的完全培养基中,于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育;用不同浓度(50μmol·L-1、100μmol·L-1)丙烯醛处理对数期培养的ARPE-19细胞24 h,设不加药的空白对照组,用流式细胞仪检测丙烯醛诱导ARPE-19细胞的凋亡情况,Western blot检测ARPE-19细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达情况。结果流式细胞仪显示,早期在空白对照组中细胞凋亡率为2.97%,50μmol·L-1丙烯醛处理组中为4.67%,100μmol·L-1丙烯醛处理组中为50.07%;晚期凋亡细胞在空白对照组中细胞凋亡率为1.66%,50μmol·L-1丙烯醛处理组中为24.24%,100μmol·L-1丙烯醛处理组中为6.77%。Western blot显示空白对照组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为0.293 9,50μmol·L-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为1.389 2,100μmol·L-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为1.496 1。结论丙烯醛可以通过激活凋亡蛋白Bax及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来导致ARPE-19细胞凋亡。

柚皮素磷脂复合物对氧化损伤的ARPE-19细胞的保护作用

目的:研究ARPE-19细胞氧化损伤模型及柚皮素磷脂复合物(NPC)对氧化损伤的ARPE-19细胞的保护作用。方法:根据文献最佳制作工艺制备NPC,测定NPC在水中的溶解度。根据不同浓度的叔丁基氢过氧化物(T-BHP)对ARPE-19细胞存活率的影响选择最佳的氧化损伤模型。将ARPE-19细胞分为溶媒组、模型组、柚皮素低剂量组、柚皮素中剂量组、柚皮素组高剂量组、NPC低剂量组、NPC中剂量组、NPC高剂量组。溶媒组用二甲基亚砜(DMSO)培养;其余各组用200μmol/L的T-BHP干预;柚皮素低、中、高剂量组分别用100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L的柚皮素干预;NPC低、中、高剂量组分别用100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L的NPC干预。MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:与柚皮素比较,柚皮素磷脂混合物、NPC在水中的溶解度均增大(P<0.01);与柚皮素磷脂混合物比较,NPC在水中的溶解度增大(P<0.01)。当T-BHP浓度为200μmol/L时,ARPE-19细胞存活率达半数,是最佳的氧化损伤模型。与溶媒组比较,模型组ARPE-19细胞存活率明显降低(P<0.01),凋亡率明显升高(P<0.01)。与模型组比较,柚皮素中、高剂量组及NPC低、中、高剂量组细胞存活率增加(P<0.05),凋亡率下降(P<0.01)。与NPC低剂量组比较,NPC中、高剂量组细胞存活率增加(P<0.05),凋亡率下降(P<0.01);柚皮素低、中剂量组细胞凋亡率升高(P<0.01)。与NPC中剂量组比较,柚皮素低、中、高剂量组和NPC低剂量组细胞存活率降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.01)。与NPC高剂量组比较,柚皮素低、中、高剂量组和NPC低剂量组细胞存活率降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.01)。结论:柚皮素形成磷脂复合物后,水溶性和生物活性提高,对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用明显增强。

槲皮素磷脂复合物激活Nrf2信号通道增强对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的研究槲皮素磷脂复合物对叔丁基氢过氧化物(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)诱导ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用及相关机制。方法采用溶剂法制备槲皮素磷脂复合物,并测定磷脂复合物在水和氯仿中的溶解度。实验细胞分组:溶媒对照组、模型对照组、槲皮素及其磷脂复合物组(含400μmol·L-1、200μmol·L-1和100μmol·L-1三个浓度)。MTT法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡,酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛、总抗氧化能力水平,荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内活性氧含量,Real time PCR、Western Blot检测细胞核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1、醌氧化还原酶-1和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达水平。结果形成磷脂复合物后槲皮素在水和氯仿中的溶解度分别为(38.36±2.91)μg·m L-1、(1351.27±28.12)μg·m L-1,较单体显著提高;浓度为400μmol·L-1、200μmol·L-1和100μmol·L-1的槲皮素及其磷脂复合物对氧化损伤ARPE-19细胞有保护作用,而且高、中浓度的槲皮素磷脂复合物的作用优于单体;浓度为200μmol·L-1的槲皮素及其磷脂复合物均能降低氧化损伤ARPE-19细胞的凋亡率,槲皮素磷脂复合物作用明显优于单体;槲皮素磷脂复合物能显著提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低细胞内活性氧、丙二醛水平,槲皮素单体则不能,但槲皮素及其磷脂复合物能提高细胞内总抗氧化能力;槲皮素及其磷脂复合物能诱导Nrf2核转位,激活Nrf2通道,上调血红素加氧酶-1、醌氧化还原酶-1和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达。结论槲皮素形成磷脂复合物后,水溶性、脂溶性提高,对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用比单体强,其作用机制与激活Nrf2信号通路,上调下游Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶的表达有关。

加减驻景方含药血清对AKT基因转染后ARPE-19细胞表达VEGF的影响

目的探讨加减驻景方含药血清对AKT基因转染后人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)细胞表达VEGF的影响。方法制备SD大鼠加减驻景方含药血清及空白血清,建立AKT基因转染ARPE-19细胞模型,体外培养,分为5个组,正常组为ARPE-19细胞常规培养,转染模型组(模型细胞,常规条件培养),含药血清组(模型细胞,给予含药血清干预培养)、空白血清组(模型细胞,给予空白血清干预培养)和阳性对照组(模型细胞,给予康柏西普干预培养)。设立不同时间和不同浓度,通过CCK-8法检测各组血清及阳性组药物对细胞毒性、增殖的影响;通过ELISA检测各组细胞上清液中VEGF的表达。结果蛋白质印迹法(Western blot)显示,转染模型组与正常组比较,AKT蛋白的表达量明显增加,差异有统计学意义(P <0.05)。CCK-8示,细胞培养24、48h后,AKT基因转染可促进ARPE-19细胞增殖(P<0. 05),培养72h后,对细胞增殖影响不大(P> 0.05)。10、20μg/ml康柏西普及5%、10%的含药血清对模型细胞的增殖有抑制作用(P <0. 05),各浓度空白血清组对模型细胞组的增殖影响不大(P>0. 05)。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测显示:转染模型组细胞上清液中VEGF表达量高于正常组(P<0. 05),康柏西普组与含药血清组均显著低于模型组(P <0.05),其中康柏西普组低于含药血清组,差异有统计学意义(P<0. 05)。空白血清组与模型组比较,差异无统计学意义(P>0. 05)。结论 AKT基因转染后可诱导ARPE-19细胞的增殖,促进VEGF的表达。加减驻景方含药血清对AKT基因转染后ARPE-19细胞的增殖及VEGF的表达有抑制作用。加减驻景方可能通过抑制VEGF的过度表达发挥干预CNV生成的作用。

异甘草素通过调节VEGFA/NF-κB通路抑制高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、迁移

目的探讨异甘草素通过调节VEGFA/NF-κB通路抑制高糖诱导的ARPE-19细胞增殖、迁移。方法异甘草素(30、60、120μmol/L)处理ARPE-19细胞24 h后,加入25 mmol/L葡萄糖24 h;将si-con、si-VEGFA质粒转染至ARPE-19细胞,加入25 mmol/L葡萄糖24 h;异甘草素(60μmol/L)处理ARPE-19细胞24 h后,将pcDNA-con、pcDNA-VEGFA质粒转染,加入25 mmol/L葡萄糖24 h。MTT检测细胞存活率;Western blot检测基MMP2、MMP9、VEGFA、CyclinD1、p-p65、p-IκBα蛋白表达;Transwell实验检测细胞迁移;PT-PCR检测VEGFA mRNA表达。结果高糖诱导的人视网膜上皮细胞ARPE-19存活率升高,MMP2、MMP9蛋白表达升高,细胞迁移数量升高,VEGFA蛋白和mRNA表达升高(P<0.05)。异甘草素处理后高糖诱导的ARPE-19细胞中细胞存活率降低,MMP2、MMP9蛋白表达降低,细胞迁移数量降低,VEGFA蛋白和mRNA表达降低(P<0.05);低表达VEGFA使高糖诱导的ARPE-19细胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表达降低,细胞存活率降低,细胞迁移数量降低(P<0.05)。异甘草素处理后高糖诱导的ARPE-19细胞中p-p65、p-IκBα表达降低(P<0.05);过表达VEGFA逆转了异甘草素对高糖诱导的p-p65、p-IκBα表达的抑制作用。结论异甘草素可抑制高糖诱导的ARPE-19细胞增殖和迁移,其机制可能与VEGFA有关。

线粒体靶向肽SS31及RIP抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的探讨线粒体靶向肽SS31及RIP抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19细胞的保护作用。方法选择400μmol·L-1 H2O2构建氧化应激损伤模型;根据MTT结果筛选出1μmol·L-1 SS31、40μmol·L-1 Nec-1作为实验最佳浓度。将培养的细胞分为对照组、SS31+Nec-1组、H2O2组、SS31+H2O2组、SS31+Nec-1+H2O2组、Nec-1+H2O2组。利用MTT测定细胞存活率,双氯荧光素染色测定细胞活性氧自由基(ROS)水平,JC-1染色测定线粒体膜电位,AnnexinV/PI双染检测细胞PI阳性率,Western blot法检测RIP3蛋白表达水平。结果与对照组相比,H2O2组细胞存活率明显降低(P<0.05)。SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组细胞存活率高于H2O2组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。荧光显微镜下双氯荧光素染色结果显示,与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组绿色荧光明显减弱,细胞内ROS含量明显减少。流式细胞仪结果显示与对照组相比,H2O2组线粒体膜电位降低的细胞比例升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组线粒体膜电位降低的细胞比例降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。AnnexinV/PI双染色结果显示与对照组相比,H2O2组PI阳性率增加;与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组PI阳性率均明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,与对照组相比,H2O2组RIP3蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组RIP3蛋白表达上调作用显著减弱,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论SS31及Nec-1对H2O2诱导的ARPE-19细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用。

黄芪含药血清对氯化钴诱导ARPE-19细胞缺氧损伤的保护作用

目的:研究黄芪含药血清对氯化钴(CoCl_(2))诱导人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞缺氧损伤的保护作用,从而探讨黄芪是否通过抗氧化应激来改善糖尿病视网膜病变(DR)。方法:建立CoCl_(2)诱导ARPE-19细胞缺氧模型,并分为以下5组:正常组(细胞正常培养,不加任何处理)、缺氧模型组(200μmol/L CoCl_(2))、空白血清组(200μmol/L CoCl_(2)+空白血清)、低剂量含药血清组(200μmol/L CoCl_(2)+10%含药血清)、高剂量含药血清组(200μmol/L CoCl_(2)+20%含药血清)。CCK-8检测细胞活性;试剂盒检测细胞上清液中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)水平;ELISA检测细胞培养基中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)的含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测VEGF、HIF-1α和脯氨酰羟化酶-2(PHD-2)的mRNA水平;Western Blot法检测VEGF、HIF-1α和PHD-2的表达情况。结果:采用200μmol/L的CoCl_(2)浓度可成功建立ARPE-19细胞缺氧模型。低剂量和高剂量黄芪含药血清可抑制缺氧诱导的ARPE-19细胞增殖(P<0.05),升高ARPE-19细胞缺氧损伤中GSH水平,降低MDA含量(P<0.05)。低剂量和高剂量黄芪含药血清可抑制ARPE-19细胞缺氧损伤上清液中HIF-1α和VEGF的表达(P<0.05),以及ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α、PHD-2的mRNA表达和蛋白表达(P<0.05)。结论:低剂量和高剂量黄芪含药血清通过抗氧化作用减轻CoCl_(2)诱导ARPE-19细胞缺氧损伤。