常压室温等离子体(ARTP)诱变对凡纳对虾不同家系幼体发育及仔虾抗逆性状的影响

为研究物理诱变对虾类前期幼体发育及抗逆性状的影响,探讨通过诱变技术增加选育群体遗传多样性和可利用遗传变异的可行性,本研究利用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对4尾来自不同家系(A、B、C和D)的凡纳对虾(Penaeus vannamei)个体所产的受精卵(原肠胚期)分别进行相同功率(360 W)、不同时间(2、4、8和12 min)的批量诱变处理,并对孵化率、肢芽期孵化畸形率、存活率、变态率以及仔虾低氧耐受性和氨氮胁迫指标进行分析。结果显示,ARTP对凡纳对虾进行诱变处理后在不同家系间有一些共性的规律,在幼体发育前期阶段,4个家系随着诱变时间的增加,肢芽期畸形率均呈上升趋势,孵化率均呈下降趋势;与未经过诱变的对照组相比,除A和D家系诱变2 min组外,其余处理组肢芽期孵化畸形率均显著升高(P<0.05);除A家系诱变2 min组外,其余各家系处理组孵化率均显著降低(P<0.05);肢芽期孵化畸形率和孵化率与诱变时间均呈现中度或高度相关;与对照组相比,A、B、C和D4个家系在相同阶段的同一处理组存活率的表现具有不定向性,A家系诱变8min组存活率显著降低(P<0.05),而C家系诱变4和8min组存活率显著升高,D家系诱变2和4 min组存活率显著降低,而诱变8 min组则显著升高。可能是诱变的不定向性以及诱变作用于个体造成的。通过存活率和各期变态率综合分析可得,低剂量(2min组)诱变死亡高峰期多发生于幼体发育后期,高剂量(4、8和12min组)诱变幼体死亡高峰期多发生于幼体发育中前期。对A家系幼体的低氧耐受性和氨氮胁迫测试结果表明,低剂量的辐射可能会在一定程度上提高低氧耐受能力;诱变2 min组和8 min组分别在氨氮胁迫实验第4天、第7天存活率很高,诱变对该家系幼体对抗氨氮胁迫的能力有一定的影响。说明ARTP诱变凡纳对虾受精卵在不同家系中幼体发育前期具有一些共性趋势,在幼体发育后期和性状的改变上具有不定向性。研究结果对凡纳对虾新种质创制及功能研究材料的制备提出了新的方法,并为凡纳对虾诱变育种提供了基础数据和科学依据。

红色诺卡氏菌高产菌的ARTP诱变选育与发酵条件优化

以红色诺卡氏菌(Nocardia rubra)FIM-PO8为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)技术进行诱变,经筛选获得遗传较稳定的Nocardia rubra高产菌株FIM-PO8-16,并通过单因素实验和正交实验优化了菌株FIM-PO8-16的发酵工艺。确定最佳发酵培养基组分为:酵母粉2.5%、葡萄糖2.5%、蛋白胨0.5%、糊精1.0%;最佳发酵条件为:种子液菌龄30 h、初始pH值7.2、接种量2.0%、装料量100 mL/500 mL、转速230 r·min^(-1)、发酵温度32℃。在此条件下,FIM-PO8-16菌体细胞浓度大幅提高,达到8.31%。

ARTP法改良变色栓菌ATCC20869发酵漆酶

变色栓菌漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,可氧化多种酚类和芳香族化合物,主产物为水且几乎不产生有毒副产物,具有较好的应用前景,但变色栓菌漆酶较低的产量限制了其进一步应用。本研究利用ARTP技术成功地从变色栓菌ATCC20869中突变出新的突变菌株TA-03。为了进一步提高漆酶产量,利用单因素摇瓶发酵实验和响应面分析法,优化了漆酶发酵条件。结果表明:在法尼醇添加量为4.48 mmol/L、硫酸铜添加量为1.90 mmol/L,pH为4.00的条件下,突变株漆酶产量达到了(283.77±8.91)U/mL。为深入探究突变菌株TA-03漆酶酶活性提高的原因,对其进行重测序和转录组分析。研究结果显示,漆酶活性区域氨基酸的突变以及新陈代谢等方面的富集导致了漆酶活性的提升。这为变色栓菌漆酶的实际应用进行了有意义的探索,提升了漆酶在发酵工业上的应用。

基于全基因组重测序对ARTP诱变的一株高产淀粉酶韩国普李斯特氏菌的关键基因研究

为提高一株海洋来源的韩国普李斯特氏菌(Priestia koreensis FS-1)产淀粉酶的能力,对该株菌采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)技术进行了诱变选育。结果显示:经过诱变选育后得到一株产淀粉酶活力较原始菌株提高了90%且稳定遗传的突变菌株P.koreensis FS-103。为解析该突变菌株酶活力增加的分子机制,对突变菌株P.koreensis FS-103进行了全基因组重测序及比对分析研究。相关分析显示:首先,P.koreensis FS-103的基因组中乙酰化修饰、抗氧化作用以及同义突变相关的基因发生了遗传变异;其次,对COG(clusters of orthologous groups)功能和变异基因进行富集分析,P.koreensis FS-103转录、翻译和翻译后修饰过程相关基因均上调。经过ARTP诱变以后的突变菌株P.koreensis FS-103淀粉酶活力提升的原因是以上功能基因发生上调效应。

高产多糖大球盖菇的ARTP诱变筛选及其菌丝培养条件优化

为获得优良的大球盖菇菌株,采用ARTP诱变处理大球盖菇孢子,通过检测诱变后的菌株菌丝生长势、拮抗作用及多糖含量,筛选菌丝生长快、多糖含量高的突变菌株;并对突变菌株菌丝多糖结构特征、红外光谱及菌丝液体培养条件进行分析。结果表明,在42株诱变菌株中,筛选得到5株生长势较好、遗传稳定,且与出发菌株有拮抗作用的突变菌株,其中菌株D1和D4的菌丝具有较高的生物量和多糖含量。D1菌株菌丝中的多糖颗粒均一、规则,粒径约为0.05μm,具有一般多糖的红外光谱特征;该菌株适宜的液体培养条件为孢子接种量8%、转速115 r·min-1、温度24℃、培养时间4 d,在此条件下菌丝生物量为56.82 mg。

ARTP-MMC高通量筛选耐木质纤维素预处理抑制物酿酒酵母的研究

为了提升酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)对木质纤维素预处理所产生的甲酸、糠醛、5-羟甲基糠醛等抑制物的耐受性,保障酿酒酵母产乙醇能力不受影响,该文以安琪超级酿酒酵母为出发菌株,研究了一种常温常压等离子体(ARTP)诱变和微液滴细胞培养(MMC)相结合的适应性进化和高通量筛选耐木质纤维素预处理抑制物的酿酒酵母方法,获得抗性强的酿酒酵母优势突变株,并评价其耐抑制物、耐高温和产乙醇能力。结果表明,菌株最佳诱变条件为:诱变功率110 W,诱变时间140 s,培养12 h,微液滴微生物培养的适应性进化复合抑制剂梯度组合为CI4~CI6,经过高通量筛选获得最佳的突变株M8;该菌株可耐受体积分数16%乙醇,具有较好的耐高温特性,55℃热激5 min可正常生长;经过10 L发酵罐培养,其最大乙醇产量为56.29 g/L,糖醇转化率为0.49 g/g,达到理论值的96.67%。该研究对木质纤维素高质化利用提供了优良的酿酒酵母,对推动纤维素乙醇具有重要意义。

ARTP诱变筛选增香、高产酒精的富硒酵母菌

为了得到产酒精和产香能力较强的枸杞内生富硒酵母菌,进而促进富硒发酵产品的开发和风味的提升,本研究以实验室保藏的枸杞内生酵母菌为实验材料,通过耐硒法和红硒法初筛得到富硒能力较强的酵母菌,采用常压室温等离子体(Atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变技术,经TTC培养基、杜氏小管发酵法、产酒精、产酯产酸、耐受性等实验筛选出增香和高产酒精的目标菌株,并用氢化物发生原子荧光光谱法测定酵母胞内和发酵液中硒含量。结果表明,富硒初筛得到了M1酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和M16葡萄牙棒孢酵母(Clavispora lusitaniae),经ARTP诱变分别筛选出产酒精能力较高的S.cerevisiae诱变菌株M1-5和产香能力较高的C.lusitaniae诱变菌株M16-28,M1-5的产酒精能力比M1提高了38.07%,M16-28的产酯能力比M16提升了107.62%,遗传稳定性均良好。经测定M1-5菌株胞内和发酵液中的硒含量分别为204.8和1158μg/L,M16-28胞内和发酵液中的硒含量分别为666.45和1830μg/L,因此,菌株M16-28比M1-5的富硒能力强,且发酵液硒含量极显著高于酵母细胞硒含量(P<0.001)。本研究筛选出诱变菌株M1-5产酒精和M16-28产香能力强的富硒酵母具有优良的发酵特性,在发酵食品和富硒功能性产品的挖掘和开发方面具有潜在的应用前景。

ARTP诱变筛选高产透明质酸菌株

透明质酸(HA)是一种由N-乙酷葡萄糖胺(GIcNAc)和D-葡萄糖醛酸(GlcA)以β-1,3和β-1,4糖苷键交替连接组成的高聚合大分子黏性多糖,具有极强的保湿作用,被称为理想的天然保湿因子,是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。马疫链球菌是目前透明质酸生产的主要菌种。菌株诱变是提升菌株性能或提高代谢产物的常用方法。采用ARTP对菌株进行诱变,通过改良CTAB比浊法进行菌株高通量初筛和摇瓶复筛,显著提高了透明质酸生产能力。经过3轮ARTP迭代诱变和筛选,最终使菌株HA产量提高了28.7%。

利用ARTP诱变技术选育白灵菇高产菌株

以白灵菇“中农1号”为试材,研究了白灵菇“中农1号”原生质体制备条件;以不做处理的“中农1号”为CK,首次采用常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma,ARTP)诱变技术,研究了其对菌株诱变后子实体产量的影响,以期获取相比CK菌株产量更高的优良菌株。结果表明:通过单因素试验得到白灵菇“中农1号”原生质体的最佳制备条件为酶解温度28℃、酶解时间3 h、溶壁酶浓度为20 mg·mL^(-1)、渗稳剂使用0.6 mmol·L^(-1)KCl。ARTP诱变最佳时间为60 s,致死率为94%时正突变率最为稳定。通过平板筛选试验初筛结果显示,生长速度快、产漆酶、纤维素酶能力强的菌株有4株,进一步通过了LBL脱色试验复筛,筛选出结实性好的4株菌株ZN-37、ZN-20、ZN-39、ZN-19。通过测定白灵菇栽培产量确定最终的高产菌株为ZN-19,总产量高达966.95g,相比CK菌株总产量多37%。

一株高产纳豆激酶菌株的ARTP诱变育种及培养基的优化

旨在提高纳豆激酶发酵水平,扩大其作为新型的纤溶药物的生产应用。利用常温室压等离子体(ARTP)技术对一株产纳豆激酶的野生菌株P进行诱变;筛选获得一株具有稳定遗传性能的纳豆激酶优势突变株P501,纳豆激酶活力比野生菌株提高了1.02倍,通过单因素实验、响应面实验对P501产纳豆激酶的发酵培养基进行优化,得到最佳发酵培养基为:葡萄糖30 g/L、玉米粉40 g/L、豆粕粉30 g/L、Na_(2)HPO_(4)3 g/L、K2HPO40.3 g/L、MgSO40.6 g/L、CaCl_(2)0.63 g/L、丝氨酸0.07 g/L、豆油0.61 g/L,经过验证实验,纳豆激酶活力最高为9691 Fu/mL,较基础发酵培养基提高了6.68倍。

ARTP诱变选育环孢菌素A高产菌株及发酵工艺优化

采用常压室温等离子体技术(Atmospheric Room Temperature Plasma,ARTP)对雪白白僵菌FIM-1809菌株进行诱变,得到一株遗传稳定性较高的突变高产菌FIM-1809-7,其产环孢菌素A能力较初始菌株提高约39%。通过单因素和正交设计试验优化,确定最佳发酵培养基组分及培养条件为:玉米浆粉6%、可溶性淀粉12%、葡萄糖1.2%、蛋白胨2%,pH 5.6,菌种菌龄为72 h,接种量10%,装液量70 m L/500 m L,发酵时间8 d,最终突变菌株产环孢菌素A效价较出发菌种增加了约53%。结果表明,采用ARTP技术结合发酵条件优化能够有效提高雪白白僵菌产环孢菌素A的能力,为该菌株的工业化应用奠定了良好的基础。

常压室温等离子体(ARTP)诱变及高通量筛选那西肽高产菌株

采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变活跃链霉菌(Streptomyces actuosu),并应用抑菌圈和48孔板培养方法高通量筛选高产那西肽菌株。研究表明抑菌圈径的大小与48孔板效价之间以及48孔板效价与摇瓶效价之间均有较好的相关性,系数R分别达到0.534和0.896。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得了3株相对效价提高50%以上的遗传性能稳定的突变株。ARTP诱变技术作为获得那西肽高产菌株的有效途径,与传统摇瓶发酵筛选相比,48孔板及抑菌圈法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。

常压室温等离子体诱变(ARTP)及高通量筛选高产蛋白酶米曲霉的初探

为提高酱油发酵菌种米曲霉的蛋白酶活力,采用实验室保藏菌种H0米曲霉为诱变出发菌株,对H0菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),诱变条件:功率120 W;气流量10L/min;10个时间梯度处理。结果表明:当诱变时间为140s时,致死率接近90%,此时为最佳诱变时间。利用大豆球蛋白作为选择培养基关键因子进行初筛和96孔板高通量复筛,选出3株高蛋白酶活力菌株H5,H12,H15,并且经过福林酚法验证。最终筛选出米曲霉菌株H15具有高蛋白酶活力:酸性、中性、碱性蛋白酶活力分别为192.35,1816.31,3774.82U/g,比出发菌株H0分别提高17.49%,19.08%,10.66%。

利用常压室温等离子体(ARTP)诱变选育高产核酸酶P1菌株

为提高核酸酶P1的发酵酶活,以桔青霉菌株CK-3为出发菌株,利用常压室温等离子体(ARTP)诱变方法,获得了3株(CK-3-1,CK-3-7,CK-3-9)高产核酸酶P1菌株,其中CK-3-9突变株酶活较高,其核酸酶Pl发酵酶活达到1232 U/m L,比出发菌株CK-3(酶活866 U/m L)提高到了42.2%,遗传实验表明稳定性好,有望用于工业化生产。

杆菌肽产生菌的ARTP诱变育种及培养基优化

为获得高产杆菌肽菌株,对海水养殖环境中分离的产杆菌肽菌株地衣芽孢杆菌ZZ061进行ATRP诱变,以藤黄微球菌为指示菌,采用抑菌圈法进行筛选,获得一株产杆菌肽水平明显提高的诱变株SF1406,其摇瓶效价比野生菌株提高130%,达到560U·mL-1。采用正交试验优化SF1406产杆菌肽培养基,结果表明:在玉米淀粉含量为3%,硫酸铵含量为1.5%,豆饼粉含量为1%,蔗糖含量为3%时效果最佳,杆菌肽效价进一步提高44%,达到810U·mL-1。

ARTP诱变选育高产油脂酵母菌

从实验室保藏的15株酵母中筛选获得一株油脂产量相对较高的酵母菌KC 8,经96 h摇瓶发酵培养后,油脂产量为1.22 g/L。利用分子生物学鉴定,该菌株的26SrDNA序列与胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)具有100%相似性;以KC 8为出发菌株,经ARTP诱变,最终从300株诱变存活菌株中筛选得到高产油脂突变菌株Y3,经96 h摇瓶发酵培养后,油脂产量为2.38 g/L;对菌株Y3的培养条件进行优化,菌株在葡萄糖为碳源,硫酸铵为氮源,碳氮比为90∶1,培养基初始pH为6.5时,在28℃恒温条件下摇瓶发酵培养96 h后,油脂产量最高达到了3.96 g/L;GC-MS对油脂组分进行分析结果表明,该脂肪酸主要由棕榈油酸、油酸、亚油酸、硬脂酸、二十碳烯酸和二十四烷酸组成,与植物油成分相似。

常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育对亚洲玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌突变株

采用常压室温等离子体(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变苏云金芽孢杆菌Bt-NBIC-380菌株,选育对亚洲玉米螟高毒力突变株。经过4轮的ARTP诱变、镜检及摇瓶发酵筛选得到的突变株Bt-NBIC-380-18-407,其摇瓶发酵液对玉米螟二龄幼虫效价达到6 835 IU/μL,杀虫晶体蛋白含量6.3 mg/mL。该突变株的效价较初始菌株提高了25.7%,杀虫晶体蛋白含量提高了18.9%。经过5次传代,证实该突变株具有良好的遗传稳定性。

ARTP辐照对两色金鸡菊种子诱变的生物学效应

ARTP(常压室温等离子体)作为一种新型安全高效的生物诱变育种手段,已成功应用于微生物的育种研究,在植物上的应用刚刚起步.本研究首次采用ARTP处理两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)种子,研究其对种子萌发、幼苗生长、花形和品质的影响,以期获得观赏价值大、品质好的诱变品系.结果表明:(1)与对照相比,不同时间(7.50～37.50min)的ARTP辐照提高了两色金鸡菊种子的发芽势和发芽率,辐照22.50min时其发芽势(80.00%)和发芽率(86.70%)达最大;不同时间的ARTP辐照也不同程度地增加了其幼苗的最大冠幅、叶片数量、叶柄长度、叶面积,以22.50min的辐照效果最好.(2)ARTP辐照种子22.50min后,其大部分植株最大花径明显增加、舌状花红褐色区域明显增大,13.33%的植株舌状花瓣数增多(Tm)、6.67%的植株雄蕊瓣化(Ts)、6.67%的植株舌状花管状化(似喇叭状)(Tt);部分植株花朵总黄酮、绿原酸和木犀草苷成分增加,其中Tt植株不仅花形发生变化且活性成分也有所提高.ARTP诱变有望成为两色金鸡菊育种的新途径.

ARTP技术选育米曲霉氨肽酶高产菌株

为提高米曲霉产氨肽酶的活性,对米曲霉CICC2066进行常压室温等离子体(ARTP)诱变处理,通过多轮筛选之后获得一株高产氨肽酶的米曲霉菌株M_(5),氨肽酶活性为241.2 U/mL,较出发的CICC2066提高了1.21倍。经过5次传代培养之后,产酶性能稳定,表明ARTP技术能够有效地提高米曲霉产氨肽酶的活性。

微生物育种物理诱变技术ARTP的应用进展

微生物物理诱变育种技术广泛应用于改善微生物菌种特性、提高微生物产品产量与质量,并且在生物燃料和生物修复方面也具有重要的应用价值。本文重点介绍常压室温等离子体(ARTP)物理诱变技术在微生物诱变育种方面的应用,其对具有重要工农业应用价值的产芽孢菌种具有明显的诱变优越性。进一步分析了微生物物理诱变育种技术未来的发展趋势和重要应用前景,为微生物物理诱变育种工作提供借鉴。