AS1.398中性蛋白酶制备水解明胶(Ⅱ)——酶的固定化研究

以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂 ,探讨了影响AS1 398中性蛋白酶的固定的因素。确定了固定化酶制备的适宜条件 :温度为 30℃～ 45℃ ,pH值为 6 5 ,时间为1 0h ,戊二醛含量为 0 1 2 % (质量分数 )和固定化酶中的酶的含量为 2 % (质量分数 )。

羧甲基壳聚糖微球固定化AS1.398中性蛋白酶的制备和性质研究

以戊二醛为交联剂,制备羧甲基壳聚糖微球固定AS1．398中性蛋白酶。研究了羧甲基壳聚糖固定化酶微球的制备条件、固定化酶的适宜温度、pH、米氏常数和储存稳定性等性质。结果表明。在pH=7．0的中性环境下；交联剂与羧甲基壳聚糖摩尔比为0．4：1；干酶与羧甲基壳聚糖的质量比为0．125：1；在室温下交联至少4h。便可得到活力相对较高的固定化酶。自由酶和固定化酶的最适宜温度分别为40℃和65℃。在70℃下，固定化酶的热稳定性比自由酶要好。自由酶和固定化酶的最佳pH分别为7．0和6．0，固定化酶具有较宽的酸碱稳定性，在pH6～8都保持较高活力。固定化酶在5℃和35℃下储存1周后酶相对活力分别为97．6％和85．1％，而没有被固定的自由酶在5℃下储存1周酶相对活力仅为61．3％。自由酶和固定化酶的Km分别为5．66g／L和1．04g／L。

AS1.398中性蛋白酶制备水解明胶(Ⅰ)——反应规律的研究

本文考察了游离AS1 398中性蛋白酶催化明胶水解反应时 ,不同温度、pH值、水解时间及酶用量等反应条件对该反应的影响规律 ,探讨了AS1 398中性蛋白酶应用于制备水解明胶工艺的可能性。

应用响应面法优化AS1.398中性蛋白酶的双水相萃取条件

选择PEG-柠檬酸钠双水相体系对AS1.398中性蛋白酶粗酶液进行萃取纯化研究,考察粗酶质量浓度、pH值、相比、离子强度等因素对酶分配的影响,并进一步采用响应面分析优化实验条件.结果表明:采用响应面方法可以有效地对系统进行选择和设计,大大方便了研究工作.选择PEG1000-柠檬酸钠体系,在粗酶质量浓度5.2 g/L、相比2、pH=7.1条件下,AS1.398中性蛋白酶的纯化倍数达3.6以上.

提高AS1.398中性蛋白酶发酵水平的研究

对中性蛋白酶生产菌AS1.398采用紫外线照射和亚硝基胍复合诱变,从上千株菌选出138株菌,用平皿快速检出法和Folin法测定酶活力,并经过复筛最终获得6株高产菌株,其中NP-72菌的酶活力达到10606u/mL,比原菌提高49%。对NP-72菌纯化分离获得NP-72-7菌,经发酵工艺优化,其摇瓶产酶活力达到11361u/mL,比原菌株提高了59.5%。

膨化大豆纤维固定化AS1.398中性蛋白酶

以膨化大豆纤维为载体 ,采用吸附 交联法固定化AS1 398中性蛋白酶 ,酶活力回收率为 4 5 % ,固定化容量为 182mg蛋白酶 / g载体 ,比活力为 90 0U /mg ,与自由酶相比较有显著提高 ,固定化酶的最适 pH由 7 0碱移至 7 5 ,最适温度由原酶的 5 0℃拓宽至 5 0～ 65℃ ,固定化酶与底物的亲和力较自由酶有所下降 ,米氏常数由自由酶的 0 0 6%变为 0 1%酪蛋白 。

AS1.398中性蛋白酶固定化条件的初步研究

考察壳聚糖、卡拉胶、海藻酸钠、琼脂等固定化载体对 AS1 .398中性蛋白酶固定化的影响。确定 0 .3%戊二醛在 30℃ ,p H8.0的条件下处理壳聚糖 8～ 1 0 h,加酶液 ,固定 8h,酶活力回收约为 77% ,固定化酶最适作用温度为 55℃ ,最适作用 p H为 8.0 ;

枯草芽孢杆菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

将编码枯草芽孢杆菌AS1.398 的中性蛋白酶功能区和包含前导区序列(“pro”序列)在内的全长基因克隆到酵母整合型质粒pPIC9K中,电转化His4 缺陷型巴斯德毕赤酵母SMD1168,通过MD-G418平板、PCR方法筛选和鉴定重组子。重组子发酵液经SDS-PAGE分析和酶活测定表明,枯草芽孢杆菌AS1.398的全长中性蛋白酶基因在毕赤酵母中获得了高效表达,表达产物分泌至培养基中,分子量约为43kD。经甲醇诱导培养后,发酵液中的中性蛋白酶活力达20000 U/mL。

AS1.398中性蛋白酶的固定化研究

本文对枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶的固定化进行了研究。考查了温度,pH值、交联剂用量,以及载体与酶的比例等因素对AS1.398中性蛋白酶固定化的影响;确定了固定化AS1.398中性蛋白酶的一些催化特性:最适温度60℃,最适pH值8.0,操作半衰期88天。固定化AS1.398中性蛋白酶活性回收为74％。

AS1.398中性蛋白酶的固定化研究

利用壳聚糖为载体 ,戊二醛为交联剂 ,对AS1.398中性蛋白酶进行了固定化研究 ,固定化反应的最佳条件是采用 1%的戊二醛浓度 ,壳聚糖和戊二醛的交联反应时间为 4h ,加入酶固定化反应12h ,固定化酶的最适温度 35℃ ,最适pH值 8.0。得到的固定化酶的活力回收平均为 82 .5 % 。

As1.398中性蛋白酶在球形壳聚糖上的固定化研究

研究了以中空球形壳聚糖固定化 As1 .398中性蛋白酶的方法 ,分析了戊二醛浓度、给酶量对固定化的影响 ,并对固定化酶的性质进行了讨论。实验结果显示 ,戊二醛质量浓度为 4% ,每克载体给酶量 2 5mg时 ,酶活力回收为 65.4% ,固定化酶的热稳定性、p H稳定性及乙醇的稳定性均高于游离酶。

多胺化壳聚糖微球固定化AS1.398中性蛋白酶

从自制的单分散微米级壳聚糖微球出发,经C2氨基苯甲醛保护、C6羟基环氧化后接枝亲水性多胺,进一步制备多胺化壳聚糖载体,采用该载体对AS1.398中性蛋白酶进行固定化.结果表明:制备的固定化酶活力回收率达49%以上,是采用未改性壳聚糖微球固定化的2.7倍.固定化酶连续重复使用9批次后仍保留有原活力的一半.

壳聚糖固定化As1.398中性蛋白酶稳定性的研究

研究了以中空球形壳聚糖固定As1 .398中性蛋白酶的方法 ,分析了戊二醛浓度、给酶量对固定化的影响 ,并对固定化酶的性质进行了讨论 ,实验结果显示 ,戊二醛质量浓度为 4 % ,每克载体给酶量 2 5mg时 ,酶活力回收为 65 .4% ,固定化酶的热稳定性。

枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶在蟹壳几丁质上的固定化作用

1.蟹壳通过酸碱处理后,可制得白色的比较纯净的几丁质。2.用戊二醛把枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶共价结合到几丁质上,并探索了固定化条件。3.固定化的枯草杆菌AS1.398中性蛋白酶和天然酶比较,最适温度向高温方向移动约3℃。最适pH基本上没有变化。底物为酪蛋白时的K_m值略变小。热稳定性和贮存稳定性明显增加,尤其在底物和Ca~存在条件下,这种稳定性更为加强。

壳聚糖固定化As1.398中性蛋白酶稳定性的研究

研究了以中空球形壳聚糖固定 As1.398中性蛋白酶的方法 ,分析了戊二醛浓度、给酶量对固定化的影响 ,并对固定化酶的性质进行了讨论。实验结果显示 :戊二醛质量浓度为 4 %、每克载体给酶量 2 5 mg时 ,酶活力回收为 6 5 .4 % ,固定化酶的热稳定性、p H稳定性及乙醇的稳定性均高于游离酶。

弹性蛋白酶调节中性粒细胞炎性募集的功能研究

目的:探索中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对中性粒细胞炎性募集的影响。方法:采用外源性弹性蛋白酶抑制剂西维来司钠盐预处理小鼠骨髓来源的中性粒细胞,通过腹膜炎过继性迁移、细胞体外趋化、流动室黏附、免疫荧光染色、细胞伸展等实验,检测NE的抑制对中性粒细胞体内炎性募集、体外趋化、牢固黏附、细胞极化与伸展能力的影响;利用流式细胞术及鲁米诺化学发光系统检测NE的抑制对中性粒细胞吞噬及活性氧(ROS)释放能力的影响。结果:西维来司钠盐预处理显著减弱了中性粒细胞体内炎性募集(P<0.001);减弱了中性粒细胞在体外趋化过程中对催化剂方向性的感知(P<0.05),减慢了趋化速率(P<0.05),降低了趋化距离(P<0.05);减少了中性粒细胞在炎性内皮细胞表面形成牢固黏附的能力(P<0.000 1),抑制了中性粒细胞对细菌的吞噬能力(P<0.01);但对中性粒细胞的伸展、极化及ROS的释放均无显著影响。结论:NE的抑制显著损害了中性粒细胞在体内外的炎性募集级联反应及吞噬作用,但对中性粒细胞的伸展、极化、ROS释放等功能无显著影响。

中性粒细胞弹性蛋白酶在支气管扩张中的生物学功能及中药干预研究进展

中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是中性粒细胞原代颗粒中的一种主要蛋白酶,参与支气管扩张复杂病理的发生、发展,具有调节炎症反应、控制感染、增加黏液分泌、降解细胞外基质和细胞因子及损害免疫系统等多种生物学功能,与疾病预后有关,可作为临床治疗结果的预测因子和可能的治疗靶点。尚未有大量高级别临床研究证明内源性及外源性NE抑制剂对支气管扩张的疗效。中医药发挥其多靶点、多途径、精准施治等作用干预NE介导的支气管扩张,在改善临床症状、减少急性加重次数、减轻气道炎症反应等方面具有优势。该文综述NE在支气管扩张中的主要生物学功能,以及中医药干预NE介导的气道炎症的进展,期望为临床和科研提供有价值的参考依据。

中性粒细胞相关蛋白酶减轻急性心肌梗死早期损伤的研究

目的:明确中性粒细胞弹性蛋白酶及蛋白酶3(neutrophil elastase/proteinase 3, NE/PR3)在心肌梗死早期损伤阶段中的作用。方法:ELISA试剂盒检测急性心肌梗死患者及健康对照组外周血中NE/PR3含量;基于冠状动脉左前降支结扎术构建心肌梗死模型,通过WB及RT-QPCR检测心肌梗死后0、1、3、7d时心脏组织中NE/PR3的表达变化;小型动物心脏超声仪进行心功能检测、免疫组化染色以及Western blot检测纤维化相关蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)变化明确敲除NE/PR3的影响。结果:心肌梗死患者外周血中NE/PR3含量以及中性粒细胞的占比均明显升高;在心肌梗死小鼠的心脏组织中表达量明显升高,且主要在梗死后1d时最为明显;NE/PR3基因缺失小鼠心肌梗死早期的纤维化程度增加、提高了心肌梗死后小鼠存活率、减少早期心脏破裂率并改善损伤早期心功能。结论:敲除中性粒细胞弹性蛋白酶NE/PR3可通过促进早期成纤维细胞活化转换为肌成纤维细胞促进心脏修复从而减少了早期心脏破裂等危险事件的发生及心脏损伤。