鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因生物信息学分析及其原核表达

【目的】了解鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因分子生物学特性,确定其编码蛋白抗原性,为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择。【方法】采用PCR克隆鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因,以DNASTAR和NCBI数据库分别进行基因生物信息学分析;利用p Cold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并分别以SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达形式及其抗原特异性。【结果】从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的AS87-01740基因编码框全长618 bp,编码205个氨基酸,理论分子量约21.87 kD,理论等电点(p I)8.2,正电荷氨基酸总数17个,负电荷氨基酸总数16个。AS87-01740蛋白序列在同种属分离株中,与2型血清型分离株(11845、YM、GD和CH-2)有很高的相似性(>99%),与1型血清型分离株(CH-1和CH-3)的相似性为92%;在不同种属中,与金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)和脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningosepticum)的相似性分别为61%、60%和57%。经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得的融合蛋白分子量约77 kD,以可溶性表达形式为主。Western blotting检测结果表明,融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应。【结论】AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性,且能与其阳性血清发生特异性免疫反应,是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原。

沉默ZEB1基因对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的影响

目的:探讨沉默锌指E盒结合同源框1(ZEB1)基因对胶质瘤U87细胞间质标志物表达和细胞迁移的作用,阐明ZEB1对胶质瘤细胞上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:将构建的ZEB1短发夹RNA(shRNA)干扰质粒(shZEB1#1和shZEB1#2)和对照质粒(shCtrl)转染至胶质瘤U87细胞,Westernblotting法检测干扰效果。将胶质瘤U87细胞分为对照组(转染shCtrl的胶质瘤U87细胞)、EMT组[转染shCtrl的胶质瘤U87细胞用转化生长因子β1(TGF-β1)诱导EMT]和ZEB1基因沉默组(转染shZEB1的胶质瘤U87细胞用TGF-β1诱导EMT)。Westernblotting法检测各组细胞中间质标志物(N-钙黏蛋白和波形蛋白)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的蛋白表达水平,划痕愈合实验检测各组细胞的迁移率。结果:Westernblotting法检测,转染shZEB1#1和shZEB1#2的胶质瘤U87细胞中ZEB1蛋白表达水平较转染shCtrl的细胞明显降低(P<0.05或P<0.01),shZEB1#2对ZEB1表达的抑制效果更明显,表明ZEB1已稳定转染到U87细胞。与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞中N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平均明显升高(P<0.05或P<0.01);与EMT组比较,ZEB1基因沉默组N-钙黏蛋白、波形蛋白和MMP-9蛋白表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)。EMT组细胞迁移率明显高于对照组(P<0.01),而ZEB1基因沉默组细胞迁移率明显低于EMT组(P<0.01)。结论:沉默ZEB1基因表达可抑制胶质瘤U87细胞EMT,并降低细胞迁移能力,提示ZEB1可作为侵袭性胶质瘤治疗的重要靶标。

8-溴环腺苷酸对人膀胱癌BIU-87细胞生长相关基因表达的影响

目的 探讨 8 溴 环腺苷酸 (8 Br cAMP)对人膀胱癌BIU 87细胞生长相关基因表达的影响。方法 体外培育的人膀胱癌BIU 87细胞受终浓度为 1× 10 -5mol/L的 8 Br cAMP处理后 ,用RNA斑点印迹技术研究与细胞生长相关的几种基因表达的变化。结果 实验组较对照组c erbB 2基因表达减弱 (478.5 0± 2 2 1.6 4对 14 0 4.0 0± 342 .2 5 ,P <0 .0 0 5 )、H ras基因表达减弱(5 5 9.0 0± 2 6 7.72对 2 36 3 .2 5± 32 4.0 0 ,P <0 .0 1)、突变型 p5 3基因表达减弱 (14 4 4.83± 35 3 .70对36 5 .0± 5 2 .13 ,P <0 .0 2 ) ;而野生型 p5 3基因表达增强 (85 3 .33± 73 .31对 1318.2 5± 35 3 .70 ,P <0 .0 0 1)。结论 8 Br cAMP可通过影响有关信号传递和细胞周期进程基因的表达而抑制细胞生长。

沉默lncRNA HOTAIR上调miR-17-5p表达增加U87R细胞放射敏感性

目的探讨lncRNA HOTAIR对胶质瘤U87R细胞和移植瘤放射敏感性影响及潜在作用机制。方法将阴性对照质粒、沉默HOTAIR质粒、过表达miR-NC质粒、过表达miR-17-5p质粒分别转染到U87R细胞中,记为沉默对照组、沉默HOTAIR组、过表达miR-NC组、过表达miR-17-5p组;以上各组细胞分别用4Gy照射,记为沉默对照+4Gy组、沉默HOTAIR+4Gy组、过表达miR-NC+4Gy组、过表达miR-17-5p+4Gy组;将沉默HOTAIR质粒分别与抑制表达miR-NC质粒、抑制表达miR-17-5p质粒共转染到U87R细胞中,记为沉默HOTAIR+抑制miR-NC组、沉默HOTAIR+抑制miR-17-5p组,转染均用脂质体法。采用qRT-PCR检测miR-17-5p和HOTAIR的表达;细胞克隆形成实验检测瘤细胞放射敏感性影响;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测荧光活性。结果HOTAIR在放射抵抗的细胞中高表达;沉默HOTAIR和过表达miR-17-5p可增加U87R细胞放射敏感性且促进放射照射诱导的凋亡。HOTAIR可靶向调节miR-17-5p表达,抑制miR-17-5p逆转了沉默HOTAIR对U87R细胞放射增敏和促进放射诱导的凋亡。结论沉默lncRNA HOTAIR对胶质瘤细胞具有放射增敏和促放射诱导的凋亡作用,其机制可能与调控miR-17-5p有关。