口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、AsiaI型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法(GICA)。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、AsiaI型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104LD50(1﹕128倍稀释乳鼠毒)的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原(SVD)、水泡性口炎(VS)、水泡性疹(VES)等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45%、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。

AsiaⅠ型口蹄疫病毒灭活疫苗毒株不同宿主系传代中VP1基因的遗传变异研究

口蹄疫病毒结构蛋白VP1参与构成病毒粒子的主要中和抗原位点,是4种结构蛋白中最易发生变异的。在病毒传代过程中,对VP1基因进行遗传变异分析是口蹄疫疫苗研制中不可或缺的环节。为此,作者扩增了经不同宿主系（乳鼠、BHK21细胞）连传不同代次的AsiaⅠ型毒株的VP1基因,并对其进行遗传变异分析,毒株间核苷酸同源性为99.4%-99.8%,推导氨基酸序列同源性为98.6%-100%;制苗毒株经过不同宿主系有限传代后,与传代前的原毒（MF1）相比,VP1基因未发生大的变异,主要抗原位点较稳定,说明以此种方式获得的制苗毒株制备的灭活疫苗是稳定的,适用于该毒株流行区域内相关家畜的免疫预防。

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。