不同毛色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中黑色素分布及ASIP蛋白的表达定位

为了研究ASIP基因在中国美利奴细毛羊被毛颜色形成过程中的作用机制,试验分别选取体况良好的3只野生型纯白色中国美利奴细毛羊,20只纯白色、8只棕色和10只黑色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊背部的皮肤组织,通过H.E.染色对比样本皮肤组织结构及黑色素分布差异;采用免疫组织化学染色检测ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊白色、棕色、黑色3种皮肤组织中ASIP蛋白的表达定位情况。结果表明:野生型与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的皮肤均由表皮、真皮、皮下结缔组织3部分组成,且表皮层最薄,各毛色皮肤结构组成无差异;黑色素颗粒主要分布于黑色、棕色ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织的毛囊、毛干中,且黑色较棕色皮肤组织中分布的黑色素颗粒更为密集,而在白色被毛的野生型和ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊皮肤组织中均未发现黑色素颗粒;ASIP蛋白在白色被毛的ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的表皮、毛囊外根鞘、毛乳头周围的毛基质中大量存在,在棕色、黑色皮肤组织中几乎不存在。说明ASIP蛋白在特定部位的表达情况与ASIP基因编辑中国美利奴细毛羊的白色被毛毛色的发生相关。

不同藏羊群体ASIP基因SNP位点筛选及其遗传分析

藏羊产于青藏高原及其毗邻地区,外部特征非常突出,杂色藏羊约占总群体的90%,被毛纯白和纯黑个体很少。为研究ASIP基因的SNPs多态性与藏羊毛色遗传之间的关系,本研究采用混池测序及PCR-SSCP法对ASIP基因7个外显子在高原型、欧拉型、扎什加型和黑藏羊4种类型藏羊群体中的突变位点进行了检测。结果共发现5个位点存在突变,分别为外显子3 g.49396C>G和外显子7的g.76594G>C、g.76715T>A、g.76732C>G和g.76811C>A。其中突变位点g.76715T>A碱基颠换引起第126位的半胱氨酸转变为丝氨酸(C126S)。而突变位点g.49396C>G在4个藏羊类型中都存在CC、CG、GG 3种基因型,该突变位点在高原型、欧拉型、扎什加型和黑藏羊群体中的最小突变概率分别为0.416、0.234、0.261、0.307,多态信息含量分别为0.485、0.358、0.386、0.424,都为中度多态。除欧拉型藏羊外,高原型、黑藏羊、扎什加型3个群体处于Hardy-Weinberg平衡状态。研究结果显示,ASIP基因g.49396C>G和g.76715T>A错义突变应是调控藏羊毛色遗传的重要位点,可为藏羊毛色的选育提供潜在的遗传标记。

中国绵羊ASIP基因突变研究

研究通过直接测序法检测ASIP基因编码区和部分内含子区域突变位点,以确定ASIP基因突变是否影响中国绵羊的被毛表型变化.结果表明:2个缺失突变(9-bp,c.10-18,D9;5-bp,c.100-105,D5)位于ASIP基因第2外显子上,3个SNPs(g.672G>A,g.1580G>A和g.1617G>A)位于第2内含子区域;D9和D5缺失突变在10个绵羊群体中都存在,而且在‘岷县黑裘皮绵羊’和‘多浪羊’群体内各出现1只D5D5基因型个体,在所有检测个体中没有发现D9D9基因型;结合绵羊被毛表型相关分析,D9和D5缺失突变与所研究的绵羊品种被毛表型不存在相关或不完全相关,即ASIP基因编码的蛋白质区域变异不能解释中国绵羊群体毛色表型的变异.

水貂ASIP基因单倍型检测及其皮肤组织mRNA差异表达分析

试验旨在探究鼠灰色(agouti signaling protein,ASIP)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)形成的单倍型及皮肤组织差异表达mRNA对水貂被毛色素沉积的影响。通过PCR扩增、Sanger测序技术对金州黑水貂、红眼白水貂和名威银蓝水貂ASIP基因进行SNPs单倍型检测分析,利用实时荧光定量PCR技术检测3种毛色皮肤组织ASIP基因的表达量,分析单倍型及mRNA差异表达与毛色表型的相关性。结果表明,301个样本中共检测到10个SNPs,内含子2中4个SNPs(G18A、A159G、G235T、C1189T)共形成10种单倍型(Hap1~Hap10),其中Hap1(GAGC)和Hap2(GAGT)是3种不同毛色水貂群体的共享单倍型;部分内含子3中6个SNPs(C252T、A290C、G298C、A340G、T343C、T379C)形成4种单倍型(Hap1~Hap4),且Hap2(CCCGCC)是名威银蓝水貂群体的主体单倍型。5个位点(A290C、G298C、A340G、T343C、T379C)均处于完全连锁不平衡状态。实时荧光定量PCR检测显示,金州黑水貂和名威银蓝水貂ASIP基因mRNA表达量分别是红眼白水貂的1.25和0.95倍,三者间差异不显著(P>0.05)。研究结果初步提示,ASIP基因调控水貂不同毛色表型形成的分子机制可能存在差异。

野猪ASIP基因的突变位点及其与毛色表型的相关性研究

本试验旨在研究影响动物被毛颜色变化的功能基因ASIP在野猪群体里的变异及其与被毛表型之间的相关性。通过直接测序法搜寻ASIP基因编码区、5′-UTR、3′-UTR和部分内含子区域突变位点。结果表明:在ASIP基因的3′-UTR区域识别了一个T→C突变位点(ASIP.c 695T→C),而在其它区域没用发现。通过群体内多态性检测,7个毛色类型的野猪在此突变位点都是CC或CT基因型,而长白猪群全部是TT基因型。从这个结果得出具有不同毛色的野猪群体可能是由突变位点C等位基因引起,不能排除还有其它毛色功能基因参与野猪被毛的形成。研究为进一步了解野猪ASIP毛色功能基因在其群体内的遗传变异奠定了理论基础。

不同毛色山羊皮肤组织Agouti基因mRNA及其编码ASIP差异表达研究

旨在探讨Agouti基因调控山羊毛色机制,采用SYBR Green real-time PCR和蛋白免疫印迹方法分别检测了不同毛色山羊皮肤组织中Agouti基因mRNA及其所编码ASIP蛋白的差异表达。结果表明,Agouti基因mRNA在白色、黑色、棕色山羊皮肤组织中的表达量依次为白色>黑色>棕色;mRNA表达量在棕色和白色、棕色和黑色山羊皮肤之间均存在显著差异(P<0.05),在白色和黑色山羊皮肤之间差异不显著(P>0.05)。ASIP在白色、黑色、棕色山羊皮肤组织中的表达量:白色>棕色>黑色;ASIP表达量在白色和黑色山羊皮肤组织之间存在显著差异(P<0.05),但在白色和棕色、棕色和黑色山羊皮肤组织之间差异均不显著(P>0.05)。研究结果提示,Agouti基因在不同毛色山羊皮肤组织中可能存在不同调控机制。

hASIP基因在乳腺癌中的表达及其意义

目的:检测hASIP基因在人乳腺癌中的表达并分析其与临床病理指标的相关性,进一步探讨hASIP与乳腺癌的关系。方法:以RT-PCR法检测人乳腺癌及癌旁组织中hASIP的表达情况,并与临床及病理常用指标作对照分析。结果:hASIP-a在癌组织中的表达率为92.5%(49/53),在癌旁组织中的表达率为75.5%(40/53),两者之间有统计学差异(P<0.05)。hASIP-b在癌组织中的表达率为54.7%(29/53),在癌旁组织中的表达率为43.4%(23/53),两者之间无统计学差异(P>0.05)。以癌旁组织为参照,hASIP-a在癌组织中表达上调的占64.2%(34/53);hASIP-b在癌组织中表达上调的占32.1%(17/53)。两者之间有显著统计学差异(P<0.01)。hASIP-a高表达与乳腺癌病人年龄>50岁、肿瘤分期早、ER阳性、病理为除浸润性导管癌外的其它浸润性癌相关(P<0.05)。结论:hASIP-a在人乳腺癌中存在高表达。乳腺癌病人年龄>50岁、肿瘤分期早、ER阳性、病理为除浸润性导管癌外的其它浸润性癌,可能是hASIP-a高表达的相关因素。

不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点筛选及其生物信息学分析

【目的】揭示刺豚鼠信号蛋白基因(ASIP)SNP位点突变与不同鸡种羽色差异形成机制的关联性,筛选出与鸡种羽色相关的辅助育种分子标记。【方法】参考NCBI已公布的红色原鸡ASIP基因序列(登录号NC_006107.5),运用Primer Premier 5.0设计特异性引物,以罗曼蛋鸡、泰和乌骨鸡、兴义矮脚鸡白羽系、赤水乌骨鸡、贵州黄鸡和瑶山鸡为研究对象,通过DNA混合池及PCR直接测序法筛选不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点;估算各SNP位点等位基因频率后,使用RNAfold、NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、SOPMA和SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,探究不同羽色鸡种ASIP基因SNP位点突变对基因mRNA二级结构、ASIP蛋白翻译后修饰位点及其二、三级结构的影响。【结果】从6个鸡种ASIP基因中检测到7个SNPs位点,分别为Exon-2-G17C、Exon-2-T168C、Exon-2-C3032T、Exon-2-T3203G、Exon-2-G3287A、Exon-2-G3313T和Exon-2-C3350T。其中,Exon-2-T3203G只出现在罗曼蛋鸡上,Exon-2-G3287A只出现在瑶山鸡上。Exon-2-T168C只出现在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系且位于编码区,该位点突变导致编码氨基酸改变[苏氨酸(Thr)→甲硫氨酸(Met)],且能导致ASIP基因mRNA二级结构改变,最小自由能增加,稳定性降低。Exon-2-T168C位点突变还导致ASIP蛋白激酶磷酸化位点数量和位置发生改变,但糖基化位点未发生改变;Exon-2-T168C位点突变后ASIP蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角和延伸链的占比增加,而无规则卷曲占比降低,且蛋白三级结构预测结果与二级结构预测结果一致。【结论】在贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系ASIP基因上检测到Exon-2-T168C位点,且该位点突变能引起ASIP基因m RNA二级结构、蛋白激酶磷酸化位点数量和位置及ASIP蛋白二、三级结构均发生改变,但并不是影响贵州黄鸡和兴义矮脚鸡白羽系羽色差异的内在机制。

酉州乌羊皮肤组织ASIP基因的RACE克隆及分析

【目的】研究酉州乌羊皮肤组织ASIP基因及其编码蛋白的结构和功能。【方法】采用RACE技术对酉州乌羊皮肤组织进行扩增,获得了酉州乌羊ASIP基因的完整转录本,并结合生物信息学方法对其结构与功能进行分析。【结果】克隆后的片段通过拼接得到一个长787 bp的序列(P1),经鉴定为酉州乌羊ASIP基因的mRNA,包括209 bp的5′UTR区,402 bp的CDS区,以及176 bp的3′UTR区,预测编码133个氨基酸,为不稳定的亲水蛋白,预测到一个约22个氨基酸的信号肽。此外,酉州乌羊ASIP基因编码区发生异义替换c.496G>T,其编码的氨基酸由丙氨酸转变为缬氨酸(p.Ala96Val),该异义替换位于负责黑素皮质素受体1(MC1R)结合活性的Agouti家族保守结构域上,造成了酉州乌羊ASIP三级结构的改变。【结论】通过对酉州乌羊ASIP基因的序列特征和蛋白结构的初步分析,推测酉州乌羊皮肤组织中ASIP基因编码区发生的异义替换可能对酉州乌羊皮肤色素沉积具有影响。

贵州白水牛ASIP、MC1R和TYR基因多态及其与白毛性状的关联分析

ASIP、MC1R和TYR是与动物毛色性状相关的重要候选基因,为了探究ASIP、MC1R、TYR基因多态性及其与贵州白水牛白色被毛之间的关系。本研究以贵州白水牛(20头)和其他毛色水牛(60头)为试验材料,针对3个基因的外显子和部分非编码序列设计引物,利用DNA池作为模板进行扩增测序,对ASIP、MC1R和TYR基因多态性与贵州白水牛被毛之间的关系做了初步探讨。结果发现,在这3个基因中均没有发现特异性的插入/缺失突变,在贵州白水牛ASIP基因的启动子中发现了突变位点:Promoter-A147T和Promoter-A235G;在MC1R基因中筛选到1个错义突变exon1-T843C,TYR基因中筛选出2个错义突变exon1-G826A、exon5-T70C,以及1个同义突变exon3-A83G。这3个基因的SNP位点在扩大样本验证时发现不具有毛色特异性,研究初步表明,ASIP、MC1R、TYR基因的多态性位点不能解释贵州白水牛毛色的特殊变异,为以后对贵州白水牛的毛色的进一步研究奠定了基础。

彩色獭兔agouti位点基因突变及蛋白结构改变对其毛色的影响

彩色獭兔是世界上重要的特种经济动物,其毛色种类繁多,因此有必要对其毛色基因开展深入研究。以不同颜色的獭兔为试验对象,首先检测彩色獭兔的agouti基因多态性,预测蛋白质的结构,构建进化树。结果发现,彩色獭兔agouti位点共发现3个等位基因,海狸色和青紫蓝色为野生型agouti,即A,紫貂色为tanagouti,即a^t;黑色、黄色和蓝色为non-agouti,即a。3种基因序列与其他兔类的同源性和进化树分析结果显示,与欧洲野兔亲缘关系最近,野生型的刺豚鼠信号蛋白(ASIP)和tan ASIP蛋白的基因均编码133个氨基酸序列,其空间结构具有24个氨基酸残基的分泌信号肽,具有富含赖氨酸的区域,C末端具有富含半胱氨酸的疏水区域,具有重要的生物学活性,而2种蛋白在序列上的差别,尤其是保守区的差别造成真黑素和棕黑素的沉积发生改变,由此造成被毛颜色的不同,non-agouti基因编码的蛋白为21个氨基酸序列,很不稳定,ASIP不能产生,导致黑色素产生和积累。

贵州矮马、西南马和伊犁马刺豚鼠信号蛋白基因的多态性

为了探索贵州矮马、西南马、伊犁马刺豚鼠信号蛋白(Agouti signaling protein,ASIP)基因与马品种毛色之间的关系,采用缺口PCR技术分析了141份贵州矮马、西南马、伊犁马的ASIP基因型,并进行克隆测序。结果表明,扩增出的793 bp和385 bp 2个片段为ASIP基因,793 bp片段中缺失一段11 bp的核苷酸,定义为a基因型,385 bp片段结构完整,定义为A基因型;3个马群体中A等位基因在骝毛中占优势;但aa基因型对应的毛色只有小部分为黑毛,绝大部分为栗毛、骝毛和复色毛,与已知的aa基因型决定黑毛的规律不相符,说明aa基因型可能不是中国马品种黑毛的决定基因型。

新疆巴什拜羊不同毛色与有关基因多态性分析

【目的】以不同毛色(红棕色73只,黑色53只,青灰色40只)新疆巴什拜羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术检测ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性,并分析其与被毛表型的相关性。【方法】采用随机抽样的方法选取出三种毛色的巴什拜羊,用枸橼酸钠抗凝管进行采血。运用软件PIC-CALC和POPGENE 32计算巴什拜羊ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的多态信息含量和基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度、有效等位基因数,并对该位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方检验。将所得数据输入Excel表中进行整理,并用SPSS 19.0软件进行差异性分析。【结果】ASIP基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型和AB型,等位基因B为红色被毛群体中的优势等位基因;等位基因A为黑色和青灰色两种被毛群体中的优势等位基因。处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),红色被毛多态信息含量处于中度多态,而黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYR基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型、AG型和GG型,等位基因G为3种毛色的优势等位基因TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而红色被毛群体中处于不平衡状态(P<0.05)。TYRP1基因存在两种基因型:AA型和GG型,等位基因A为红色和青灰色两种毛色的优势等位基因;等位基因G为黑色被毛群体的优势等位基因。TYRP1基因在巴什拜羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。红色被毛多态信息含量处于高度多态,黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYRP2基因PCR-SSCP检测结果没有显示多态。【结论】ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性与巴什拜羊的毛色性状有相关性。

基于RNA-Seqs的乌苏里貉agouti基因结构特征预测及分子进化分析

为了进一步分析agouti基因的分子结构特征,利用生物信息学方法对RNA-Seqs试验获得乌苏里貉agouti基因的完整编码区序列的碱基组成及其编码蛋白的结构特征进行了预测和分析,并采用非对组算数平均法(UPGMA)法构建系统发育树。结果表明,获得的乌苏里貉agouti基因cDNA长度为530bp,含396bp开放阅读框(ORF),编码131个氨基酸。预测乌苏里貉agouti蛋白分子质量为14.41ku,等电点(pI)为9.68,为不稳定疏水性蛋白;含有11个磷酸化位点、1个糖基化位点和1个长达24个氨基酸的信号肽;预测发现无规则卷曲为其主要二级结构。系统进化树结果显示乌苏里貉与赤狐、家犬遗传距离最近,这与传统的动物分类学一致。通过对乌苏里貉agouti基因分子结构特征的分析,为揭示其影响毛色多样性的分子遗传学机制提供理论依据。

鸭毛囊中ASIP基因片段的克隆及组织表达分析

根据GenBank发表的鸡刺鼠信号蛋白(ASIP)基因序列的同源保守区域,设计了1对特异性引物。以番鸭、高邮鸭和英系北京鸭(即樱桃谷鸭)毛囊RNA为模板,经扩增、测序及拼接得到的部分mRNA序列均为编码序列,共308bp,对应编码102个氨基酸。与已发表的原鸡和鹌鹑的ASIP对应的mRNA核苷酸序列进行比对,番鸭、高邮鸭和英系北京鸭的同源性均在92.53%以上,相应编码的氨基酸序列同源性均高于92.16%。高邮鸭与英系北京鸭核苷酸,氨基酸序列一致,同源性为100%。半定量PCR结果显示,番鸭ASIP基因表达具有较高的普遍性,在皮肤组织(毛囊和皮肤)和中枢神经系统(下丘脑)及其他非皮肤中均有表达。皮肤和毛囊的表达差异不显著(P>0.05),下丘脑中的ASIP基因相对表达量最高,极显著高于皮肤中ASIP基因的表达量(P<0.01),而与毛囊中的差异不显著(P>0.05)。

灵长类毛色基因研究进展

毛色在动物生活中起着信息交流和伪装等作用。灵长类不同物种之间、同一物种不同个体之间都有着丰富的毛色,然而,毛色变化的分子机制却研究得较少。已有的研究发现,灵长类毛色变化既不能归因于某些毛色基因的序列差异,也不能归因于毛色基因表达量的差异。本文对灵长类的毛色、灵长类的毛色基因(主要是MC1R和ASIP基因)的研究进行了简要的概述,以期为灵长类毛色基因的进一步研究提供参考。