探针ASPCR检测肺炎支原体微量耐药突变A2063G方法的建立

目的 建立能够特异性检测微量肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)A2063G耐药突变基因的特异性扩增等位基因的探针法实时定量PCR(probe-based allele-specific real-time PCR,探针ASPCR)方法。方法 建立特异性检测A2063G耐药突变位点的探针ASPCR方法,并验证其灵敏度、特异度及准确度等性能。结果 特异性扩增2063G和非特异性扩增2063A/G的引物/探针组合分别扩增105拷贝野生基因型(2063A)模板的Ct值的差(△Ct)高达10.93,能够特异性检测A2063G突变。探针ASPCR方法检测2063G基因型占总MP的比例的准确度可低至1%;检测MP的灵敏度低至10拷贝,检测A2063G耐药突变比例的灵敏度低至0.01%。探针ASPCR方法与前期建立的染料ASPCR方法检测临床样本的MP感染结果一致,MP阳性检出率均为94.83%(55/58),高于传统巣式PCR联合测序方法的检测结果(75.86%,44/58);染料ASPCR方法检测MP耐药率为70.91%(39/55),高于探针ASCR方法的检测结果 63.64%(35/55)。结论新建探针ASPCR方法是一种具有高特异度、准确度和灵敏度的快速检测MP微量A2063G耐药突变的方法;与染料ASPCR方法相比,探针ASPCR方法检测耐药MP的灵敏度略低,但其临床样本检测复查率也低于染料ASPCR方法,且其结果判读简单,更适合在临床中应用推广,能够为临床制定MP及耐药MP感染的治疗方案提供理论依据。

ASPCR检测微量HIV-1 K103N耐药突变方法的建立

目的建立检测微量HIV-1 K103N耐药突变的等位基因特异扩增实时定量PCR（allele-specific real-time PCR，ASPCR）方法，用于微量K103N耐药突变的检测和分析。方法首先建立检测K103N耐药突变的ASPCR方法，然后对方法进行验证，最后采用ASPCR方法检测对照样本。构建含K103N突变的质粒作为标准品，然后设计特异性引物用以区分野生型和突变型模板，采用SYBRgreen法进行实时定量PCR，并绘制标准曲线。分别采用特异性和非特异性引物扩增模板，根据二者Ct（cycle threshold）值结合相应的标准曲线判断是否存在K103N突变及突变比例。对ASPCR检测K103N突变位点的特异性、敏感性、准确性、重复性等进行验证。结果特异性和非特异性引物扩增等量野生型模板的Ct值之差（△Ct）可达13．56；当突变比例小于0．1％时仍具有良好的准确性；批内变异系数小于0．7，批间变异系数小于1．6；检测灵敏度可达0．01％。检测阴性对照样本的△Ct显著高于临界值，阳性对照样本检测结果均为阳性。结论ASPCR是一种快速、灵敏、准确的检测HIV-1微量耐药突变的方法，可为临床抗病毒治疗提供理论指导。

略论基因诊断

本文是关于基因诊断的原理及其分子生物学技术的概述．着重介绍了基因探针和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹、聚合酶链式反应（ＰＣＲ）及等位基因特异聚合酶链式反应（ＡＳ－ＰＣＲ）和限制性片段长度多肽性（ＲＦＬＰ）分析的原理、方法、技术特点和应用范围．最后，讨论了其发展前景．

运用AS-PCR方法及SOE技术研究猪α干扰素

采用AS PCR方法和SOE技术相结合的策略 ,通过找出猪α干扰素基因内部的特异位点 ,设计引物扩增出两个DNA片段并将其连接为全长基因。所得片段编码序列长 5 0 1bp ,共编码 16 6个氨基酸。与已知PoIFN α1基因有 5个碱基差别 ,导致

用等位基因扩增及银染进行β地中海贫血诊断

应用等位基因特异性扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）银染进行β地中海贫血的基因诊断，并与琼脂糖凝胶电泳相比、结果发现ＰＡＧＥ银染色得到了更多、更清晰的电泳条带，２例难以判断的Ｘ型突变在ＰＡＧＥ银染下呈现清晰阳性结果．结果表明，该方法具有微量灵敏，准确可靠的优点，尤适用于小片段ＤＮＡ电泳分析．

河南某农村艾滋病患者劣势耐药毒株的进化及原发耐药研究

目的了解河南省部分艾滋病患者抗病毒治疗效果及耐药发生情况，分析劣势耐药毒株在该人群本底存在情况。方法以河南某农村149名初始接受抗病毒治疗的艾滋病患者为研究对象，采用自建（In-house）基因型耐药检测方法分析抗病毒治疗失败患者HIV-1耐药发生情况，对抗病毒治疗后产生耐药的病例采用等位基因特异性实时定量PCR（allele-specificreal-timePCR，ASPCR）方法检测其抗病毒治疗前样本劣势耐药毒株存在情况。结果抗病毒治疗后患者的HIV-1病毒载量显著下降（t=275，P：0．0001），但CD4’T淋巴细胞绝对数无明显变化（t=1．765168，P=0．0852）。抗病毒治疗失败患者中耐药的发生率为4．88％，ASPCR检测发现，在调查基线时，7例耐药患者全部存在劣势M184V突变，5例存在劣势K103N突变。结论河南省部分未治疗的艾滋病患者存在HIV-1原发性耐药毒株，劣势耐药突变可能发展为优势耐药毒株并影响抗病毒治疗的效果。