非小细胞肺癌中ASPP1、ASPP2蛋白的不同表达状态及其意义

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)中ASPP1、ASPP2蛋白表达规律及其与p53表达状态的相关性。方法:收集NSCLC术后同一病人的新鲜肺癌组织、癌旁组织、肺组织共54例用于试验研究。采用免疫组织化学Envision法检测肺癌组织、正常肺组织中ASPP1、ASPP2蛋白表达及癌组织中p53表达以确定各病例的p53表达状态;W estern blot方法检测肺癌组织、癌旁组织、正常肺组织中ASPP1、ASPP2蛋白表达。结果:p53阴性状态:W estern b lot显示癌组织、癌旁组织、正常肺组织中ASPP1表达量逐渐升高(P=0.012),比较发现癌组织ASPP1蛋白表达水平显著高于肺组织(P=0.029);ASPP2表达在癌组织、癌旁组织、正常肺组织中表达无显著性差异。p53阳性状态下,免疫组织化学与W estern b lot检测结果均显示ASPP1、AS-PP2蛋白在癌组织、癌旁组织、肺组织中表达比较无显著性差异。癌组织ASPP1蛋白表达在p53阴性时显著低于p53阳性;癌组织ASPP2表达在p53阴性时与p53阳性无统计学意义。癌旁组织、肺组织中ASPP1、ASPP2表达与p53表达状态无相关性。结论:p53阴性状态下,NSCLC癌组织ASPP1表达降低,ASPP2表达无明显变化,ASPP1表达降低与NSCLC的发生密切相关。

ASPP2以p53非依赖形式促进自噬引起Hep3B细胞凋亡

p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡的功能,进而发挥抗肿瘤作用.本室前期研究发现,ASPP2可以通过p53-DRAM-自噬途径诱导细胞凋亡.在本研究中,利用ASPP2腺病毒感染Hep3B细胞(p53缺陷型肝癌细胞系)并用甲基磺酸(MMS)处理后;Calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡;GFP-LC3质粒转染细胞后检测自噬;荧光定量PCR和免疫印迹检测自噬基因表达.结果表明,ASPP2在p53缺陷的Hep3B细胞内可诱导发生凋亡;在MMS存在和缺失条件下,Adr-ASPP2均引起自噬体水平升高及自噬基因的表达增加,且MMS协同Adr-ASPP2能使自噬水平增加;进一步用VPS34 siRNA和DRAM siRNA抑制自噬发现,细胞凋亡水平下降,说明由Adr-ASPP2诱发经损伤相关自噬调节蛋白(DRAM)介导的自噬参与了肝癌细胞系凋亡的发生.综上结果表明,ASPP2可以通过非p53依赖的DRAM介导自噬,并促进肝癌细胞凋亡.该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.

ASPP2过表达可增强DRAM介导的自噬对HepG2细胞的促调亡作用

p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能特异性地与p53蛋白结合并增强其促凋亡功能,进而发挥抗肿瘤作用.最近文献提示,自噬对肿瘤发生、发展及肿瘤细胞对抗肿瘤药物的反应都具有重要作用.在本研究中,甲基磺酸(MMS)处理HepG2细胞24 h后,用calcein AM/PI和M30染色检测细胞凋亡,可引起早期(M30免疫组化阳性)和晚期细胞凋亡(PI染色阳性).给HepG2细胞转染GFP-LC3质粒后,发现MMS处理24 h可引起自噬的发生.ASPP2腺病毒(rAd-ASPP2)感染HepG2细胞引起ASPP2过表达后,再用MMS处理24 h,能引起更明显的早期、晚期细胞凋亡和自噬.荧光定量PCR检测发现,rAd-ASPP2诱导了更高的BCL-2相关X蛋白基因(BAX)和p53蛋白的目的基因p53诱导的自噬调节蛋白(p53-induced modulator of autophagy,DRAM)的表达.但仅用rAd-ASPP2处理HepG2细胞不能引起自噬和凋亡.利用2条DRAM特异性的siRNA下调DRAM的表达,发现rAd-ASPP2引起的自噬被完全抑制,早期和晚期凋亡均部分被抑制,同时BAX的mRNA水平也明显下降.以上结果说明,ASPP2可通过上调BAX和DRAM基因的转录而促进MMS引起的HepG2细胞凋亡;另外,DRAM介导的自噬是ASPP2促进MMS引起的肿瘤细胞凋亡的机制之一.该研究可为肝癌的基因治疗提供新的思路.

异构体ΔASPP2可拮抗ASPP2对p53(细胞)凋亡功能的增强作用

p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis stimulating protein 2 of p53,ASPP2)能够与p53蛋白结合特异性地增强其促细胞凋亡功能,进而发挥肿瘤抑制作用.我们发现的1个比ASPP2少300多个N端氨基酸的异构体ΔASPP2.目前,ΔASPP2对p53起何种作用尚不清楚.在本研究中,我们构建了rAd-ASPP2、rAd-ΔASPP2腺病毒,利用rAd-p53、rAd-ASPP2、rAd-ΔASPP2感染p53缺失的细胞系H1299,在MMS的作用下研究ASPP2和ΔASPP2对p53介导的细胞凋亡的影响.结果发现,p53自身过表达能明显促进肿瘤细胞的凋亡;ASPP2可显著增强p53介导的MMS引起的H1299细胞凋亡的作用;然而,ΔASPP2对p53介导的细胞凋亡没有明显影响但却显著抑制rAd-ASPP2增强的rAd-p53的促细胞凋亡作用.p53-ASPP2复合体可能改变p53蛋白的构象,促进p53和增强子Bax的结合活性.p53转录调控基因的表达研究显示,ΔASPP2的存在可显著抑制ASPP2增强p53介导的bax基因转录活性,提示ΔASPP2可能与ASPP2结合后来抑制p53的凋亡基因转录活性.

TP53BP2/ASPP2通过p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬

目的研究肿瘤蛋白p53结合蛋白2/p53凋亡刺激蛋白2(TP53BP2/ASPP2)对HepG2人肝癌细胞自噬的调节作用和机制。方法通过腺病毒、慢病毒感染HepG2细胞上调或下调细胞中ASPP2的表达,HepG2细胞继续在不含胎牛血清的培养基中培养24 h,通过Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、beclin1、P62、自噬相关基因5(ATG5)、ATG7和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路相关蛋白mTOR、磷酸化的mTOR(p-mTOR)、真核转录起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)、磷酸化的4EBP1(p-4EBP1)、核糖体蛋白S6、磷酸化的S6(p-S6)、核糖体S6激酶B1(RPS6KB1/p70S6K)、磷酸化的p70S6K(p-p70S6K)的蛋白表达,荧光显微镜检测细胞表达的绿色荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3(GFP-LC3)融合蛋白。同时,使用慢病毒感染不表达p53的Hep3B细胞,敲低细胞中的ASPP2水平,Western blot法检测Hep3B细胞ASPP2和mTOR通路相关蛋白mTOR、p-mTOR、4EBP1、p-4EBP1、S6、p-S6、RPS6KB1/p70S6K、p-p70S6K的蛋白表达。结果当ASPP2的表达上调时,mTOR复合物1(mTORC1)通路被激活,并且自噬相关蛋白的表达和自噬体的数量减少。在下调ASPP2表达后,mTORC1通路受到抑制,自噬相关蛋白的表达水平和自噬体的数量增加。在p53表达沉默的Hep3B细胞中,当ASPP2下调后,mTORC1途径仍然受到抑制。结论ASPP2以p53非依赖性方式激活mTOR通路抑制HepG2人肝癌细胞自噬。