强力霉素可调控的双重稳定表达AT2R的骨髓间充质干细胞的建立

目的构建四环素类抗生素可调控的双重稳定表达AT2R的骨髓间充质干细胞。方法将四环素可调控系统（Tetracycline-on，Tet-on）的4种质粒用脂质体转染法连续两个回合转染体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞并抗性筛选，分别采用发光计检测不同细胞克隆荧光素酶活性改变以及RT-PCR法检测AT2R目的基因表达情况，根据各个细胞克隆受强力霉素调控表达的程度，筛选出高诱导、低背景表达目的基因AT2R的骨髓间充质细胞系，并检测在不同浓度（0～10^4ng／ml）强力霉素干预下以及转染后不同时间（0～8周）目的基因的蛋白表达情况。结果连续两个回合的转染及筛选后获得的引入Tet-on系统的细胞系，高诱导低背景表达AT2R，在强力霉素诱导下48h内可以使AT2R表达显著增加，强力霉素在一定浓度范围内可以诱导AT2R的表达呈剂量依赖性的增加，且至少在8周内保持稳定。结论构建的含四环素调控系统的骨髓间充质干细胞系诱导活性可靠，使外源AT2R基因的表达处于有效的主动控制下。

AT2R基因在体转染抑制大鼠颈动脉新生内膜增生

目的:探讨AngⅡ2型受体(AT2R)基因在体转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的抑制作用。方法:大鼠颈动脉球囊损伤后,局部转染AT2R重组腺病毒载体(pAdCMV/AT2R)或空病毒载体(pAd-GFP),于术后7、14和21 d用RT-PCR、免疫组织化学及HE染色方法,进行AT2R、AngⅡ1型受体(AT1R)、PCNA在颈动脉壁中表达的变化及定量组织形态学分析;免疫荧光双标染色和激光共聚焦技术检测血管中AT2R与PC-NA表达的关系。结果:pAdCMV/AT2R转染后,大鼠颈动脉AT2R的表达水平显著高于未转染组和pAd-GFP组(P<0.01),21 d时仍维持较强表达。在14 d时pAdCMV/AT2R组PCNA阳性表达率显著低于未转染组和pAd-GFP组[(27.29±5.81)%vs(72.25±4.47)%、(68.43±9.12)%,P<0.01],在AT2R表达阳性的部位PCNA表达阴性。在21 d时,pAdCMV/AT2R组的内膜面积与中膜面积比显著低于未转染组和pAd-GFP组(0.78±0.06vs1.44±0.22、1.36±0.21,P<0.01),pAd-GFP组和未转染组间无显著差异(P>0.05);各组颈动脉AT1R表达水平无显著差异(P>0.05)。结论:AT2R基因在体转染可抑制球囊损伤后大鼠颈动脉平滑肌细胞增殖和新生内膜增生,AT2R基因转染后表达并发挥其生物学作用时,AT1R和AT2R之间不存在表达量上此起彼伏的关系,可能是建立在信号转导基础上的功能调节关系。

AT2R基因可调控表达对体外培养VSMC纤维黏连蛋白表达的影响

目的利用Dox-on可调控哺乳动物表达系统,建立起了受四环素类似物Doxycycline(Dox)紧密调控、表达AT2R基因的双重稳定血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC),在此基础上对纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)的表达受AngⅡ及其受体拮抗剂的影响进行研究。方法建立Dox可调控表达AT2R基因的双重稳定大鼠VSMC细胞,观察该VSMC细胞中AT2R受调控表达情况,以及血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)及其1型、2型受体拮抗剂干预上述细胞后FN的mRNA及蛋白表达情况变化。结果Dox-on可调控哺乳动物表达系统可成功介导AT2R基因在原代培养大鼠主动脉VSMC的表达,该表达受到Dox给予/去除的紧密调控;Dox干预可在48h内迅速诱导该VSMC细胞表达AT2R,AT2R表达在Dox干预后72h进一步增强(P<0.01)。AT2R基因的可调控表达抑制由于AngⅡ干预VSMC后引起FN表达的增强(P<0.01)。这一作用被AT1R拮抗剂CV-11974进一步增强(P<0.01);而被加入AT2R拮抗剂干预而取消;同时给予AT1R拮抗剂和AT2R拮抗剂时FN的表达与基础状态时的情况一致。结论AngⅡ干预增强FN的表达,该作用是通过AT1R介导的;经Dox诱导表达AT2R基因可以明显抑制这一生物学作用,说明在这一生物学效应上,AT2R具有与AT1R相拮抗的生物学功能。

AT2R转染表达促进人肾间质纤维母细胞凋亡

目的 探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)基因表达对人肾间质纤维母细胞凋亡的影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV -AT2R) ,转染培养的人肾间质纤维母细胞 ,用流式细胞仪检测AT2R细胞表达率 ,RT -PCR方法检测AT2R ,bcl -2和baxmRNA表达 ,肾间质纤维母细胞凋亡用流式细胞仪、原位末端标记法检测。结果 构建的AdCMV -AT2R转染培养肾间质纤维母细胞表达率为 90 6 %。AT2R峰值表达时 ,其凋亡发生率较未转染组增加 3 2倍 (P <0 0 1) ,bax表达增加 76 3 % (P <0 0 5 ) ,bcl-2则无明显变化 ,TUNEL检测结果表明转染组出现大量凋亡细胞。结论 AT2R转染表达可显著增加体外培养肾间质纤维母细胞的凋亡 ,这对延缓肾间质纤维化是有益的。

AT1R、AT2R、RAGE在糖尿病大鼠脑组织中的表达及意义

目的探讨血管紧张素Ⅱ受体-1(AT1R)、血管紧张素Ⅱ受体-2(AT2R)、高级糖基化终末产物受体(RAGE)在糖尿病大鼠脑组织损伤中的可能作用。方法 40只SD大鼠随机均分为糖尿病组和对照组。链脲佐菌素注射后12周末处死大鼠,留取脑组织标本,行HE染色观察其病理学改变,采用免疫组化Evision二步法检测脑组织中AT1R、AT2R、RAGE及基质金属酶9(MMP9)的表达,并将糖尿病组AT1R、AT2R、RAGE、MMP9进行相关性分析。结果糖尿病组较对照组大鼠脑组织病理学显示脑小血管周隙明显增宽,但两组脑组织均无炎细胞浸润;糖尿病组大鼠脑组织AT1R、AT2R、RAGE、MMP9阳性细胞数较对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);糖尿病组大鼠AT2R与MMP9、RAGE、AT1R均呈正相关(P<0.05),AT1R与MMP9、RAGE呈正相关(P<0.05),MMP9与RAGE呈正相关(P=0.001)。结论糖尿病大鼠脑组织存在水肿,提示有血脑屏障异常,其机制可能与AT1R、RAGE、MMP9的过度表达或AT2R的激活以及它们之间的相互作用有关。

AT2R基因在体电穿孔转染抑制大鼠颈总动脉新生内膜增生

目的探讨AngⅡ2型受体(AT2R)基因局部电穿孔转染对大鼠颈总动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响。方法建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型,用局部电穿孔方法转染AT2R真核表达载体(pEGFP-AT2R)或空载体(pEGFP-N2),分别于术后7、14 d和21 d采用HE染色及RT-PCR方法进行AT2R、AngⅡ1型受体(AT1R)在颈动脉壁中表达的变化和组织形态学分析,检测其对在体血管新生内膜的影响作用。结果球囊损伤21 d后,pEGFP-AT2R组大鼠颈动脉AT2R mRNA表达为(1.262±0.317),pEGFP-N2组为(0.396±0.100),单纯损伤组为(0.410±0.053),pEGFP-AT2R组与pEGFP-N2组和单纯损伤组相比差异有统计学意义(P<0.01);球囊损伤后21 d时AT1R的表达,pEGFP-AT2R组为(0.469±0.065)、pEGFP-N2组为(0.363±0.046)、单纯损伤组为(0.373±0.045),pEGFP-AT2R组较pEGFP-N2组和单纯损伤组相比差异有统计学意义(P<0.05),pEGFP-N2组和单纯损伤组间无统计学差异(P>0.05);球囊损伤后21 d,pEGFP-AT2R组的内膜面积与中膜面积比(I/M)为(0.828±0.101),pEGFP-N2组为(1.432±0.086),单纯损伤组为(1.515±0.078),pEGFP-AT2R组较pEGFP-N2组和单纯损伤组相比差异有统计学意义(P<0.01)。pEGFP-AT2R组与单纯损伤组相比,使实验动物新生内膜增生平均受抑制率达45.35%。结论在体血管局部电穿孔转染AT2R基因可使AT2R在损伤血管组织表达较单纯损伤组明显增加。AT2R基因与AT1R基因之间在表达量上不存在此消彼长的关系。

AT2R基因可调控表达对体外培养VSMC基质金属蛋白酶2表达的影响

目的 研究血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)基质金属蛋白酶 2形成的影响 ,旨在探讨AT2R基因在VSMC上条件表达在再狭窄防治中的潜在意义。方法 本研究通过常规分子生物学方法 ,建立四环素类似物Doxycycline可调控表达AT2 R基因的双重稳定VSMC细胞系。应用RT PCR和免疫细胞化学染色技术 ,观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中基质金属蛋白酶 2的mRNA及蛋白表达情况 ;采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )及其Ⅰ型、Ⅱ型其受体拮抗剂干预上述细胞 ,观测上述指标的变化。结果 Doxycycline干预前 ,AT2R的表达处于静止状态 ,通过Doxycycline(1μg/ml)的干预 ,可以使该VSMC系稳定表达AT2R。加入Doxycycline前转染组低水平基质金属蛋白酶 2 ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后基质金属蛋白酶 2的mRNA及蛋白表达均显著增加 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ干预的同时加入Doxycycline后 ,基质金属蛋白酶 2的mRNA及蛋白表达受到显著抑制 (P<0 .0 1) ;ATIR拮抗剂CV 11974可进一步下调上述mRNA及蛋白的表达 ;AT2R拮抗剂PD12 3319干预组基质金属蛋白酶 2mRNA及蛋白仍旧强表达 (与AngⅡ组比较 ,P >0 .0 5 )。 结论 AngⅡ干预VSMC后通过ATIR介导引起基质金属蛋白酶 2表达增强 ;

AT2R基因可调控表达在血管紧张素Ⅱ介导的体外培养VSMC增殖中作用

目的 研究血管紧张素Ⅱ 2型受体 (AT2R)基因可调控表达对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)表达细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (CDK2 )、增殖细胞核抗原 (PCNA)以及 p2 1的影响 ,旨在探讨AT2R基因在VSMC上条件表达在再狭窄防治中的潜在意义。方法 本研究通过常规分子生物学方法 ,建立四环素类似物Doxycycline可调控表达AT2 R基因的双重稳定VSMC细胞系。应用RT PCR和免疫细胞化学染色技术 ,观察该双重稳定表达AT2R的VSMC细胞系中CDK2、PCNA及 p2 1的mRNA及蛋白表达情况 ;采用血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )及其Ⅰ型、Ⅱ型其受体拮抗剂干预上述细胞 ,观测上述指标的变化。 结果 ①加入Doxycycline前转染组低水平表达CDK2、PCNA ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后CDK2、PCNA表达显著增加 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ 10 - 7mol/L干预的同时加入Doxycycline后 ,CDK2、PCNA的表达受到显著抑制 (P <0 .0 1) ,但仍高于基础水平 (P <0 .0 1) ;ATIR拮抗剂CV 11974可进一步下调CDK2、PCNA的表达 ;AT2R拮抗剂PD12 3319干预组CDK2、PCNA强表达 (与AngⅡ组比较 ,P >0 .0 5 )。②加入Doxycy cline前转染组 p2 1表达处于高水平 ;AngⅡ 10 - 7mol/L干预VSMC后 p2 1表达显著降低 (P <0 .0 1) ;在AngⅡ 10 - 7mol/L干预的同时加入Doxycycline后 。

AT2R转染表达抑制人肾间质成纤维细胞迁移活性

目的 探讨血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)基因表达对人肾间质成纤维细胞 (hRIF)迁移活性的影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制型腺病毒载体 (AdCMV -AT2R) ,转染培养的hRIF ,用流式细胞仪检测AT2R细胞表达率 ,RT -PCR方法检测AT2RmRNA表达。用改良Boyden’s趋化小室和激光共聚焦显微镜检测hRIF迁移活性。结果 构建的AdCMV -AT2R转染培养hRIF表达率为 90 6%。改良Boyden’s趋化小室检测表明 ,迁移细胞数抑制比例最高可达 62 2 % (P <0 0 1) ,激光共聚焦显微镜检测表明 ,转染组F -actin表达明显受抑制。结论 AT2R转染表达可显著抑制hRIF迁移活性 。

VS MC转染表达AT2R对AT1R表达的影响

目的 探讨血管平滑肌细胞 (VSMC)转染表达血管紧张素Ⅱ (AngⅡ ) 2型受体 (AT2R)后其 1型受体 (AT1R)表达所受的影响。方法 用同源重建方法构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV AT2R) ,体外转染VSMC ,分别用流式细胞仪检测AT1R、AT2R细胞转染表达率、免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达、RT PCR法和蛋白印迹法检测其mRNA和蛋白表达。结果 AdCMV AT2R转染后 ,在不同浓度AngⅡ刺激下AT1R、AT2R在VSMC的细胞转染表达率如下表。如果表明随着转染表达时间延长 ,AT2R细胞表达率呈显著增加趋势 ,4 8小时最高表达率达 89.5 1% ,AngⅡ作用与否及不同浓度AngⅡ作用对AT2R表达无显著影响。而转染前后AT1R表达相对较稳定 ,受不同浓度AngⅡ作用 ,其表达明显呈增加趋势。AT2R峰值表达时 ,免疫组织化学法和免疫荧光法检测其膜表达结果也提示AT2R表达随转染表达时间延长显著增加 ,转染前后AT1R表达无明显变化 ,在一定浓度范围内 ,AngⅡ刺激对AT2R表达无显著影响 ,却显著增加AT1R的膜表达。RT PCR法和蛋白印迹法检测AT1R和AT2R的mRNA和蛋白表达结果与其细胞表达率和膜表达的检测结果相一致。结论 生理状态下 ,VSMC主要表达AT1R ,AT2R表达较少或不表达。AT1R表达受一系列因素影响 。

腺病毒介导AT2R基因转染表达抑制肾间质纤维母细胞增殖

目的 探讨人肾间质纤维母细胞 (hRIF)转染表达血管紧张肽Ⅱ (AngII)受体 (AT2R)对其增殖的影响。方法 构建带AT2R基因的重组复制缺陷型腺病毒载体 (AdCMV AT2R) ,体外转染hRIF ,用RT PCR方法检测AT2RmRNA表达 ,流式细胞仪检测AT2R表达率 ,用细胞周期分析、分裂指数、MTT比色法和 5 溴尿苷 (BrdU)掺入法检测hRIF增殖。结果 构建的AdCMV AT2R体外转染培养hRIF表达率为 90 6 %。AT2R峰值表达时 ,其S期和G2 M期细胞比率从 31 7%降低到 13 9% (P <0 0 5 ) ,分裂指数从 37 4%降低到 9 6 % (P <0 0 1) ,MTT吸光度和BrdU掺入量分别降低 6 0 1%和 5 4 2 % (P <0 0 1)。结论 AT2R转染表达可显著抑制体外培养hRIF的增殖 。

宁夏回族人群AT2R基因多态性与原发性高血压的相关性研究

目的:探讨宁夏回族人群AT2R基因多态性与原发性高血压的相关性。方法:选择在本院内科诊治的宁夏回族人群原发性高血压患者150例作为观察组,同期选择150名血压正常者作为对照组,应用片段长度多态性PCR方法检测AT2R^(C3123A)位点基因多态性。结果:两组性别、年龄、体质量指数、血糖等对比无显著差异(P>0.05),观察组的收缩压、舒张压显著高于对照组(P <0.05)。两组基因型分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05),AT2R^(C3123A)位点的三种基因型CC、AA、CA在观察组、对照组之间的频率分布差异有统计学意义(P <0.05)。结论:宁夏回族人群AT2R基因多态性与原发性高血压有一定的相关性,AT2R^(C3123ACA)基因型的增加可导致高血压发生率增加。

《自然》报道张海涛研究员团队药物靶标AT2R结构研究成果

2017年4月5日，《自然》（Nature）在线发表了浙江大学药学院张海涛研究员团队题为《血管紧张素Ⅱ受体的选择性和多样性的结构基础》（structural basis for selectivity and diversity in angiotensin Ⅱ receptors）的论文（http：／／www．nature．com／nature／joumal／vaop／ncurrent／full／nature22035．html）。该研究应用最新的自由电子激光技术（XFEL）和同步辐射，首次解析了AT2R与两种药物先导化合物的复合物晶体三维结构，其中一种是AT2R选择性配体，另一种是AT1R／AT2R双靶点配体，并通过一系列构效关系研究、分子对接、分子动力学和突变实验，系统阐明了不同亚型血管紧张素Ⅱ受体的配体选择性和功能多样性的结构基础，从而为基于结构的AT1R／AT2R靶向药物研究提供了关键信息。

Interferon Regulatory Factor 5 and Renin-Angiotensin-Aldosterone System Polymorphisms in Coronary Artery Disease: An Overview of Experimental and Clinical Studies

Heart diseases are the main cause of mortality in Mexico, being coronary heart disease the most frequent in the country. Its high prevalence makes important the study of the pathophysiology and the search for prognostic factors. Different genes and polymorphisms promote atherogenesis and coronary artery disease, they affect inflammatory and vascular pathological processes. Interferon regulatory factor 5 (IRF5) is associated with coronary heart disease, it promotes chronic inflammation and cytokines release;it could trigger immune reactions and its activating receptors express in the vascular endothelium. Besides, polymorphisms in the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) are implied with coronary disease, they are found in angiotensinogen (AGT), angiotensin II type 1 receptor (AT1R), angiotensin II type 2 receptor (AT2R), and angiotensin-converting enzyme (ACE) genes. These genetic polymorphisms are associated with a prothrombotic state, endothelial dysfunction, and immune activation. Multiple experimental studies showed that chronic activation of RAAS and chronic expression of IRF5 generates an environment prone to the development of atherosclerosis, and autoimmune and cardiovascular diseases. Studying these specific genes and their relationship with coronary heart disease will allow a better understanding of the pathological process and possibly the quest for new treatments.

化合物21(C21)抑制晚期糖基化终产物刺激引起的大鼠肾小管上皮细胞的细胞因子分泌

目的研究2型血管紧张素Ⅱ受体(AT2R)激动剂化合物21(C21)对晚期糖基化终产物(AGE)刺激的NRK-52E大鼠近端肾小管上皮细胞分泌的细胞因子的影响及潜在机制。方法培养NRK-52E细胞,分为正常对照组和(25、50、100、200)mg/L AGE-牛血清白蛋白(BSA)刺激组。培养48 h后收集细胞,采用实时定量PCR检测NRK-52E细胞白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA的表达。间接ELISA检测细胞培养上清液中的IL-6、TNF-α蛋白水平。然后先用25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后分别给予(0.01、0.05、0.1)mmol/L C21分别处理24 h,采用实时定量PCR检测细胞蛋白激酶C(PKC)、核因子κB p65(NF-κB p65)及转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA的表达,Western blot法检测细胞中PKC、NF-κB p65、TGF-β1蛋白表达。结果不同剂量的AGE-BSA刺激NRK-52E细胞均可明显增加IL-6、TNF-α的mRNA表达,而以25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞时,其IL-6、TNF-α的蛋白分泌增加更明显。以25 mg/L AGE-BSA刺激NRK-52E细胞48 h后,(0.01、0.05、0.1)mmol/L C21分别处理24 h,均可显著抑制AGE-BSA所诱导的NRK-52E细胞PKC、NF-κB p65及TGF-β1 mRNA和蛋白的表达。结论AGE-BSA促进NRK-52E细胞IL-6、TNF-α、PKC、NF-κB p65及TGF-β1表达,C21则抑制其作用。

基于RAS双轴探讨中药对新型冠状病毒肺炎的干预机制

探讨新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)肺损伤及多脏器损害与肾素-血管紧张素系统(RAS)双轴ACE/AngⅡ/AT1R、ACE2/Ang(1-7)/Mas的关联,提示血管紧张素转化酶2(ACE2)在介导SARS-CoV-2感染的易感性和免疫性中可能起双重作用。鉴于ACE2靶向治疗进退两难的境地,提出血管紧张素2型受体(AT2R)及Ang(1-7)/Mas受体或可作为中药干预的靶点。基于RAS双轴下游的信号通路,探讨中药治疗COVID-19可能的干预机制。人体内肺、胃肠、肾和血管上皮细胞高表达ACE2,印证了中医对病位主要在肺,可累及脾胃、肾和血脉的认识。根据病位,清肺、健脾、泄浊、化瘀或为主要治则。

蒙药乌兰温都苏-11丸对自发性高血压大鼠Ang-Ⅱ受体AT1R、AT2R蛋白表达的影响

目的:研究乌兰温都苏-11丸对自发性高血压大鼠(SHR)心、肾、血管组织中AT1R、AT2R蛋白表达的影响。方法:SHR大鼠60只和同源相匹配的Wistar Kyoto(WKY)大鼠10只,随机分为模型组、对照组、缬沙坦胶囊组、丹参酮Ⅱ_A硫酸钠注射液组、乌兰温都苏-11丸低、中、高剂量组,每组10只。对照组和模型组给予蒸馏水,缬沙坦胶囊组、蒙药乌兰温都苏-11丸低、中、高剂量组每天同时按相应剂量灌胃药物、丹参酮Ⅱ_A磺酸钠注射液组相应剂量腹腔注射药物。给药治疗4周后,采用蛋白质免疫印迹方法分别检测大鼠心、肾、血管中血管紧张素Ⅱ受体AT1R、AT2R蛋白表达水平。结果:Western blot的检测结果表明乌兰温都苏-11丸干预显著降低SHR大鼠心、肾、血管的血管紧张素Ⅱ受体AT1R蛋白表达水平,同时显著增加血管紧张素Ⅱ受体AT2R蛋白表达水平。结论:乌兰温都苏-11丸治疗能够明显抑制AT1R蛋白表达,并显著激活AT2R蛋白表达。其作用机制可能是可通过拮抗血管紧张素Ⅱ受体AT1R的同时激活血管紧张素Ⅱ受体AT2R调节高血压,对高血压引起的靶器官损伤有一定的防治作用。

血管紧张素-Ⅱ2型受体基因多态性与高血压心脑血管病的研究进展

血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensinⅡtype 2 receptor,AT2受体)是近年研究的热点,其主要发挥拮抗血管紧张素Ⅱ1型受体的作用,起着舒张血管,降低血压,调节水盐代谢,抑制细胞增殖,促进细胞分化、凋亡等作用,这些作用提示其对心脑血管系统生长发育、功能的平衡稳定以及疾病的发生发展过程都有重要的意义。