高AT含量DNA片段PCR扩增体系的优化

选用4种不同长度(1.0~5.4 kb)、高AT含量(72%~80%)的真菌线粒体DNA片段,通过比较4种PCR添加剂(牛血清白蛋白(BSA)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺和镁离子)和4种KOD系列DNA聚合酶(KOD-Plus-、KOD-Plus-Neo、KOD FX和KOD FX Neo)对PCR扩增效果的影响,优化高AT含量DNA片段的PCR扩增体系。结果表明:当PCR体系中单独使用1种添加剂时,只有镁离子能够促进扩增,其他3种添加剂都不能产生预期扩增条带。BSA和DMSO对镁离子的扩增促进作用无负面影响,而甲酰胺会抑制镁离子的扩增促进作用。当镁离子存在时,4种KOD聚合酶的PCR体系均可获得预期的扩增产物;当缺乏镁离子时,使用KOD-Plus-或KOD-Plus-Neo聚合酶的PCR体系未能得到扩增产物,表现出对镁离子的依赖性。镁离子对高AT含量DNA片段的扩增具有促进作用,最佳使用浓度为1.75 mmol/L。研究结果为其他真核生物中高AT含量DNA片段的扩增提供了方法依据。

起始密码子下游区域AT含量优化工具BestAT的开发与应用

基因的表达水平受到起始密码子下游区域AT含量的影响,从巨大的序列集中筛选出具有特定AT含量和密码子用法特征的同义序列是一个繁琐的工作。本文研发AT含量优化工具"BestAT",初步解决了自动获取海量同义序列和充分展示同义序列的密码子用法特性两个关键问题,并且实现了与密码子用法数据库(CUD)的无缝结合,采用了密码子参数的原位标示和AT含量曲线等直观方式展示序列特性,为这类实验设计提供有力的支持。

高致病病毒序列中高AT含量回文结构的研究

统计分析了SARS病毒及其他几种冠状病毒全序列、艾滋病病毒全序列、丙型肝炎病毒全序列中,中间间隔S从0～100、侧翼序列长度L从4开始的所有回文结构.通过分析不同S,L的回文结构的频数以及AT含量,发现了一些特殊的回文结构,这些特殊结构的共同特点是AT含量高,而且都处于病毒中编码重要蛋白的序列中.综合考虑3种高致病病毒序列中高AT含量的回文结构的特点及其所处位置的特殊性,推测高AT含量的回文结构是某种具有生物学意义的结构,在病毒的侵入、复制等方面扮演着非常重要的角色.

ExoCET-BAC策略高效抓取和组装高AT含量基因组大片段

基因克隆是解析基因功能的重要手段,但仍有很多基因难以克隆,比如高AT含量(>60%)基因组来源的DNA。ExoCET克隆技术通过联合核酸外切酶介导的体外同源重组和大肠杆菌RecET重组酶介导的细胞内同源重组,不仅能从微生物基因组中靶向抓取>100 kb的大片段,而且能高效组装>13个DNA片段,是基因克隆的有力工具,迄今未有利用ExoCET技术从AT含量>63%的基因组克隆大片段的报道。本研究以AT含量为69%的海洋单细胞光合蓝细菌原绿球藻MIT 9301菌株的基因组为研究对象,探究了利用ExoCET技术进行高AT含量基因组大片段克隆的最佳条件。结果显示:①在核酸外切酶介导的体外同源重组时使用Gibson体系较T4聚合酶体系能获得更高的克隆效率;②载体应选择单拷贝的细菌人工染色体(BAC),多拷贝质粒载体会导致克隆失败;③ExoCET可以从原绿球藻基因组上抓取>80 kb的大片段,并且能以100%的正确率组装11个3 kb的DNA片段;④可以一步同时抓取4个7~20 kb的基因组大片段。大规模基因组测序显示高AT含量生物占比超过30%,该研究建立的ExoCET-BAC策略将为高AT含量生物的基因组功能研究提供高效使能技术。

枯草杆菌基因组中的回文结构

统计了枯草杆菌全序列中中间间隔S从0到29、侧翼序列长度L从4开始的所有回文结构,以及这些回文结构在编码区和非编码区的分布。通过分析不同S、L的回文结构的频数以及AT含量,发现枯草杆菌基因组中长的回文结构是过表达的、AT含量高并且对非编码区有偏好。

爱滋病病毒全序列回文结构的研究

统计分析了爱滋病病毒全序列中中间间隔S从0到100、侧翼序列长度L从4开始的所有回文结构,通过分析不同S、L的回文结构的频数以及AT含量,发现回文结构的AT含量普遍高于全序列的AT含量.有三种辅助蛋白(Vif、Vpu、Nef)存在于病毒颗粒内,我们找出编码这三种蛋白的DNA序列,并统计出它们的回文结构,分析它们的AT含量及回文数密度(平均每1000个碱基中包含的回文数),并与丙型肝炎病毒序列回文结构进行对比.发现编码Vpu(HIV-1特有的蛋白)蛋白序列的回文结构在AT含量,和回文数密度方面均显示其特性.由此推测高AT含量的回文结构在HIV-1中起到重要作用.

SARS病毒序列中回文结构的研究

统计了SARS病毒全序列中间间隔S从0到100、侧翼序列长度L从4开始的所有回文结构,并从AT含量及频数分布等方面分析了不同区域(编码及非编码区域等)回文结构的特征,同时,找出SARS病毒及其它几种冠状病毒各蛋白编码序列,并统计出它们中的回文结构,分析它们的回文特征,发现了一些SARS病毒序列中回文结构的分布规律,如L大于7的回文主要分布在编码区;绝大部分编码蛋白序列的回文结构数密度小于整个SARS病毒序列回文结构数密度等.

甘油脱氢酶基因在大肠杆菌中的密码子优化表达

【目的】利用密码子优化技术,提高甘油脱氢酶基因gldA在大肠杆菌中的表达水平。【方法】针对gldA起始密码子下游区域,优先选择AT含量最高的同义密码子,从而在不改变氨基酸序列的前提下,提高该区域的AT含量。利用大引物PCR的方法对野生型gldA-WT进行定点突变,获得优化型基因gldA-4,与pET-32a(+)连接后,构建表达质粒pET-gldA-4,转入E.coli BL21(DE3),得到工程菌E.coli-4。同时,设定包含gldA-WT的工程菌E.coli-WT作为对照,摇瓶发酵后,以甘油为底物检测比较表达产物的酶活力。【结果】gldA-4相对gldA-WT而言,改变了第2、5、6位密码子中的4个碱基,AT含量从53.3%提高到80.0%。相应地,E.coli-4的粗酶液的酶活力为191.3 U/mL,比E.coli-WT的48.3 U/mL提高了3倍多。【结论】本优化方案简便、快捷,但可明显提高甘油脱氢酶的酶活力,有望成为改善目的基因异源表达水平的一种通用方法。