miR-155-5p靶向ARID2对口腔鳞状细胞癌有促进作用

目的 探讨miR-155-5p对口腔鳞状细胞癌(OSCC)细胞增殖、迁移和侵袭的调控作用和机制。方法 收集人口腔癌细胞系CAL-27、HN4、HN6、SCC4、TCA8113和正常口腔上皮角质细胞系HOK,检测miR-155-5p表达。根据转染质粒的不同分为miR-NC组(转染miR-155-5p模拟物阴性对照)和miR-155-5p组(转染miR-155-5p模拟物)、anti-NC组(转染miR-155-5p抑制物阴性对照)、anti-miR-155-5p组(转染miR-155-5p抑制物)、Vector组(转染空质粒载体)、pc-ARID2组(转染ARID2过表达质粒)、miR-NC+Vector组(共转染阴性对照和空质粒载体)、miR-155-5p+Vector组(共转染miR-155-5p模拟物和空质粒载体)和miR-155-5p+pc-ARID2组(共转染miR-155-5p模拟物和ARID2过表达质粒)。采用CCK-8实验、克隆形成实验检测细胞增殖情况,分别采用划痕实验和侵袭实验检测CAL-27细胞、HN4细胞的迁移、侵袭情况,采用免疫印迹法检测ARID2蛋白的表达情况。采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-155-5p与ARID2的靶向关系。结果 与正常口腔上皮角质细胞系HOK比较,OSCC细胞系(SCC4、HN6、HN4、CAL-27、TCA8113)miR-155-5p表达均显著上调(P<0.01)。与anti-NC组比较,anti-miR-155-5p组miR-155-5p相对表达量显著降低(P<0.01),增殖活性、克隆形成数、划痕闭合率和侵袭细胞数均显著降低(P<0.01)。与miR-NC组比较,miR-155-5p组ARID2蛋白表达显著下调(P<0.01),增殖活性、克隆形成数、划痕闭合率和侵袭细胞数均显著升高(P<0.01);anti-miR-155-5p组ARID2蛋白表达显著上调(P<0.01),增殖活性、克隆形成数、划痕闭合率和侵袭细胞数均显著降低(P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验证实,与共转染miR-NC和pmiR-ARID2野生型质粒(pmiR-ARID2-wt)比较,共转染miR-155-5p mimic和pmiR-ARID2突变型质粒(pmiR-ARID2-wt)后荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。与Vector组比较,pc-ARID2组ARID2 mRNA表达显著上调(P<0.01),增殖活性、克隆形成数、划痕闭合率和侵袭细胞数均显著降低(P<0.01)。与miR-NC+Vector组比较,miR-155-5p+Vector组增殖活性、克隆形成数、侵袭细胞数和划痕闭合率均显著升高(P<0.01);与miR-155-5p+Vector组比较,miR-155-5p+pc-ARID2组增殖活性、克隆形成数、侵袭细胞数和划痕闭合率均显著降低(P<0.01)。结论 OSCC细胞中miR-155-5p表达上调,并可通过靶向抑制ARID2表达促进OSCC细胞增殖、迁移和侵袭,进而发挥致癌基因作用。

基于CRISPR/Cas9系统构建ARID2基因敲除模型并探索其对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的:通过成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)系统在SK-Hep1肝癌细胞系中构建AT富集作用域2(AT-rich interaction domain 2,ARID2)基因敲除模型,并初步观察ARID2敲除对肝癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法:设计并合成靶向ARID2的向导RNA(single guide RNA,sg RNA)寡核苷酸序列,长度为20 bp,构建到CRISPR表达载体上,转染HEK293T细胞包装慢病毒并筛选稳定细胞株,采用克隆形成、Transwell和划痕实验分别检测细胞增殖和迁移能力。结果:目的 sg RNA寡核苷酸双链成功插入酶切后的Lenti CRISPER-V2质粒载体中且测序正确;经Western blot鉴定ARID2敲除的细胞株筛选成功;ARID2基因敲除后,与亲本细胞系相比,其蛋白表达缺失;克隆形成实验结果示ARID2敲除细胞株(1#6)培养至10 d时克隆形成数为(125.600±5.131)个,亲本细胞株克隆形成数为(69.000±5.567)个(t=12.962,P=0.000);ARID2敲除细胞株(2#1)培养至8 d时克隆形成数为(94.000±8.737)个,亲本细胞株克隆形成数为(67.000±5.292)个(t=4.635,P=0.010),差异有统计学意义。Transwell结果示ARID2敲除细胞株(1#6)在24 h的迁移细胞数为(180.000±5.542)个,亲本细胞组的迁移细胞数为(90.400±5.031)个(t=20.731,P=0.000);ARID2敲除细胞株(2#1)在24 h的迁移细胞数为(138.600±5.749)个,亲本细胞组的迁移细胞数为(78.400±5.703)个(t=12.891,P=0.000),差异有统计学意义。划痕实验结果示ARID2敲除细胞株(1#6)16 h划痕愈合度为(88.000±0.011)%,亲本细胞组划痕愈合度为(52.500±0.047)%(t=12.490,P=0.000);ARID2敲除细胞株(2#1)16 h划痕愈合度为(71.900±0.020)%,亲本细胞组划痕愈合度为(55.200±0.024)%(t=9.190,P=0.001),差异有统计学意义。结论:ARID2敲除可明显促进肝癌细胞的增殖和迁移能力,证实ARID2作为抑癌基因参与肝癌的发生和进程。ARID2敲除细胞模型为肝癌的深入研究提供新的手段。

染色质重塑基因ARID2在乳腺Paget病中的表达及临床病理分析

目的探讨染色质重塑基因-AT富集作用域2基因(AIRD2)在乳腺Paget病(MPD)发生发展中的作用和临床意义。方法选取2011年3月至2019年1月徐州医科大学附属医院收治的30例MPD伴发乳腺癌患者,对其MPD石蜡包埋组织标本及伴发的乳腺癌石蜡包埋组织标本共30对,采用免疫组织化学法检测ARID2及乳腺癌分子标志物[雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人类表皮生长因子受体2(HER2)和肿瘤细胞增殖核抗原(Ki-67)]的表达情况,并采用免疫荧光原位杂交(FISH)检测HER2的表达。分析配对样本间ARID2的表达差异,及ARID2表达与乳腺癌分子标志物、分子分型(根据ER、PR、HER2结果进行分型)、临床病理参数、生存时间的关系,同时分析配对样本间分子表型的一致性。结果ARID2在MPD中阳性率为66.7%,在伴发的乳腺癌组织中阳性率为30.0%,差异有统计学意义(P<0.01)。ARID2的表达与MPD中ER、PR、HER2、Ki-67的表达、伴发乳腺癌类型及分子分型无明显关联性(P均>0.05),与淋巴结转移、分期及生存时间亦无明显关联性(P均>0.05)。ER、PR、HER2的表达和分子分型在MPD表皮内瘤细胞与伴发乳腺癌两种组织中的一致率分别为70.0%、73.3%、96.7%和63.3%,两种组织的表达一致率以HER2最高。结论MPD表皮内病变与伴发的乳腺癌关系密切,ARID2在MPD的发生发展中起作用,尤其HER2可能在MPD的发生发展中起重要作用,但其表达的意义和机制尚待进一步研究。