基于单细胞ATAC测序数据的乳腺癌上皮细胞转录因子研究

研究表明,乳腺肿瘤细胞染色质开放区域上的转录因子显著影响乳腺癌患者的临床表型和预后。然而,在单细胞层面,这些调控元件如何调控乳腺癌发生发展尚不明确。为此,本研究从GEO数据库中下载了45216个正常和肿瘤乳腺组织的单细胞染色质可及性测序(single-cell ATAC sequencing,scATAC-seq)数据,并对其进行了分析。根据标记基因在细胞群的基因活性得分进行细胞类型注释后得到7种乳腺细胞类型。皮尔逊相关性分析表明,肿瘤和正常乳腺样本的上皮细胞存在明显的染色质可及性差异,且乳腺上皮细胞存在高度样本间异质性(PCC=-0.07),暗示其是乳腺肿瘤的主要恶性细胞类型。为了探究正常和恶性乳腺上皮细胞的差异可及性区域中转录因子结合基序的富集情况,在提取上皮细胞群后对4个上皮细胞亚型的特征开放区域进行了转录因子结合基序富集分析。结果表明,恶性乳腺上皮细胞有194个转录因子显著富集(P<0.001),它们可能涉及乳腺肿瘤发展和转移等调控过程。对上皮细胞亚型中富集程度较高的转录因子进行活性分数计算及转录组数据验证,结果进一步显示这些差异调控元件可能与乳腺细胞恶性发展相关。此外,对转录因子结合基序在不同乳腺癌亚型中的可及性差异进行了分析,发现SNAI2在三阴性乳腺癌样本中具有显著高的可及性,提示SNAI2在三阴性乳腺癌中具有潜在的特异性调控作用。

ATAC-seq在复杂疾病研究中的应用进展

染色质转座酶可及性测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq)是利用Tn5转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术。ATAC-seq可以在全基因组范围内绘制染色质可及性图谱,揭示转录因子结合位点以及核小体的位置。在医学领域,ATAC-seq技术是研究重大疾病发病机制、药物作用机制、新药研发和生物标志物功能等的新一代有力工具。本文对ATAC-seq技术的优势及其在复杂疾病研究中的应用和前景进行了综述,以期为人类复杂疾病基因表达调控机制等相关研究的开展提供借鉴与参考。

利用ATAC-seq技术研究Ⅰ型干扰素通路活化后人单核细胞的染色质开放性改变

目的检测人单核细胞经干扰素α(interferon α,IFNα)刺激后在全基因组水平上的染色质开放性变化。方法收集健康人外周血单核细胞,运用基于转座酶和高通量测序的染色质分析(assay for transposase-accessible chromatin using sequencing,ATAC-seq)技术检测染色质开放性。使用生物信息学工具进行富集分析和可视化分析。结果经过 IFNα处理后,染色质开放性发生显著增加的区域有 430 个,显著降低的区域有 442 个;大部分开放结构位于基因的启动子和临近区域,其次是基因间区域以及基因的内含子区域。富集分析显示,染色质开放性明显增加的区域所关联的基因涉及的生物学过程大多是与干扰素相关的信号通路和抗病毒反应。可视化相应的染色质区域,效应性干扰素诱导表达基因(interferon-stimulated gene,ISG)的启动子及转录起始位点区域在 IFNα刺激之后 ATAC-seq 信号强度明显增强;而调节性 ISG 在 IFNα刺激前即已具备一定程度的开放性,刺激之后开放性有所增强。开放性增强区域含有干扰素刺激反应元件以及干扰素调控因子等重要转录因子的识别基序。结论Ⅰ型干扰素刺激后,人单核细胞的染色质开放性发生了特征性改变,为下游的相关基因表达做出准备。

联合应用RNA-seq和ATAC-seq寻找FOXQ1转录因子的下游靶基因

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是一种全球高发的恶性肿瘤,发病原因复杂且预后较差。近年来发现叉头框Q1(Forkhead box Q1,FOXQ1)基因作为一类核转录因子在结直肠癌中高表达,可控制下游基因转录活性。本实验拟探究CRC细胞中FOXQ1的转录调控功能并寻找其下游基因。方法:(1)构建低表达FOXQ1基因的稳定转染CRC细胞株;(2)应用RNA seq检测FOXQ1敲低前后表达量显著差异的基因;(3)应用转座酶可接近性核染色质区域测序分析(Assay for Trans posase-Accessible Chromatin using sequencing,ATAC seq)检测FOXQ1敲低前后细胞染色质易接近性的变化;(4)进一步对FOXQ1敲低前后的RNA seq和ATAC seq数据进行一系列生物信息学分析,寻找CRC中FOXQ1转录调控的潜在下游基因。结果:应用RNA seq筛选出了敲低FOXQ1后表达显著差异的基因EI24、TLR2、SMAD3,通过联合分析两细胞系的测序结果,发现FOXQ1基因敲低后,在DLD1和SW480两个细胞系中染色质易接近性均增强且表达量均上调的基因有61个,染色质易接近性均减弱且表达量均下调的基因有70个,且EI24、TLR2、SMAD3基因均位于重叠分析结果中,其中TLR2、SMAD3基因的染色质区域有明显变化,而EI24基因的染色质区域变化不明显。通过代谢通路分析找到了EI24、TLR2、SMAD3基因所富集的代谢通路。其中SMAD3、TLR2基因在炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)通路中显著富集。EI24基因在p53信号通路(p53 signaling pathway)通路中显著富集。结论:基于染色质易接近性的变化和转录水平的研究发现:敲低FOXQ1基因对CRC细胞系中染色质的开放情况有较大的影响,且影响FOXQ1转录调控的下游基因的表达。找到了FOXQ1敲低后在SW480、DLD1中均发生变化的基因,为丰富FOXQ1转录因子的下游调控网络提供了研究基础。

染色质开放状态对食管癌相关通路影响及关键基因分析

目的:探讨染色质开放状态对食管癌相关通路的影响及对关键基因进行分析。方法:从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载食管癌染色质开放性高通量测序(ATAC-seq)数据,使用R4.2.1对2组数据分别进行基因注释,并进行KEGG通路富集分析与GO功能富集分析;对食管癌RNA-seq数据进行差异分析,筛选出与染色质开放状态相关性较高的2个基因ARL5B和RUNX1,并绘制KM生存曲线;对ARL5B、RUNX1进行单因素与多因素COX分析。结果:食管癌中ATAC-seq数据的峰值距离转录起始位点≤1 kb、1~2 kb、2~3 kb所占百分比分别为32.59%、6%、4.41%,位于远端基因间区的峰值占27.15%,这种现象和染色质开放区域的分布相一致。染色质开放区峰值绝大多数存在于转录起始位点附近,符合染色质开放性的特点。KEGG和GO功能分析结果显示,注释基因在Rap1信号通路、Hippo信号通路、ErbB信号通路、mTOR信号通路等明显富集。ARL5B高表达的食管癌患者预后较差(P<0.05),RUNX1高表达的食管癌患者预后较好(P<0.05)。结论:染色质开放状态在调节食管癌的发生和发展方面发挥重要作用,ARL5B、RUNX1基因可能成为食管癌的治疗靶点和预后指标。

适用于多种禾本科植物染色质转座酶可及性测序的提核建库方法

为建立适用于多种禾本科植物染色质转座酶可及性测序(assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq)的细胞核提取和建库体系,本试验以水稻、小麦和结缕草的叶片及根系为研究材料,通过控制变量试验确定最佳的细胞核提取方法:采用液氮研磨样品,初步提核离心速度选取1200×g,2次ORB溶液去除细胞器等杂质,蔗糖梯度缓冲液纯化细胞核。通过构建文库、库检及测序分析发现,所提取的细胞核适用于染色质转座酶可及性测序的建库,可获得高质量测序数据。本试验建立的适用于多种禾本科植物的提核体系为获取禾本科植物染色质开放区域信息以及深入研究基因表达的调控方式奠定了基础。

间充质干细胞成骨分化早期染色质开放区域的动态变化

目的:在全基因组水平观察骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化早期染色质开放区域的动态变化。方法:原代培养人骨髓MSCs至第6代,成骨诱导剂分别刺激0、3、5和7 d。收集各组细胞,运用ATAC-seq技术(基于高通量测序的转座酶可接近染色质分析)检测染色质开放区域,并对各组间染色质开放区域数量、开放区域的DNA基序以及邻近基因功能进行生物信息学分析。结果:在MSCs成骨定向分化早期的不同时点,细胞染色质开放区域数量发生显著动态变化;各组功能性区域peak分布主要富集在转录起始点附近;motif分析显示各组细胞间参与转录调控的活化DNA发生细微改变;新增染色质开放区域的生物学过程主要集中在各种GTP酶活性的调节、细胞外基质组成、Wnt信号通路等;而新增的基因显著性富集信号通路主要集中在Rap1信号通路、黏着斑、黏着连接等。结论:在骨髓MSCs成骨定向分化早期,各时段的染色质开放区域发生了显著的特征性改变。

利用染色质开放性测序技术探讨叶酸缺乏对胚胎干细胞基因组结构变化调控影响

目的 利用染色质开放性测序技术(ATAC-seq)探讨叶酸缺乏对小鼠胚胎干细胞(mESC)全基因组染色质结构影响特征。方法 使用4mg/ml浓度的正常叶酸培养基培养mESC24h作为正常对照组,使用终浓度为0.12μM的叶酸代谢障碍药物甲氨蝶呤(MTX)处理mESC24h作为MTX实验组,分别行ATAC-seq,获得胚胎早期全基因组染色质开放图谱。进行正常对照组及MTX实验组染色质开放区域数量、开放区域涉及基因功能及通路分析比较。结果 确立转座酶Tn57.5U消化正常对照组mESC,Tn55U消化MTX实验组mESC,获得清晰核小体周期条带建立ATAC-seq测序体系,分别设置3个生物学重复进行二代测序。MTX处理后开放性染色质结构数量明显减少(P<0.05);MTX处理后差异染色质开放区域主要集中在胚胎器官形成、细胞周期调控、神经骨骼系统发育及生殖系统发育有关基因(P<0.01);MTX实验组和正常对照组差异基因显著性富集pathway集中在MAPK信号通路、细胞骨架调控、Rap1信号通路等(P<0.01)。结论 叶酸缺乏能够引起mESC基因组染色质开放性结构变化,涉及器官形成、细胞周期调控等重要发育基因及生理代谢通路相关基因,可能引起后续基因表达调控改变。

染色质转座酶可及性测序研究与数据分析

在真核生物中,染色质作为遗传物质DNA的载体,直接参与基因的表达调控。染色质的可及性是指染色质中的DNA能与转录因子等蛋白复合物结合的区域,对染色质可及性的测定可为获取开放区域的信息、核小体定位信息以及转录因子结合信息提供基础依据。随着高通量测序技术的进步以及测序成本的降低,研究者已开发多种研究染色质可及性的测序方法,该文介绍4种常见的染色质可及性测序方法,对其中的染色质转座酶可及性测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq)的原理和数据分析方法进行重点描述,讨论ATAC-seq的应用与发展趋势,为染色质可及性以及基因表达调控的研究提供参考。

染色质可及性分析的研究进展

在细胞核内,染色质可及性模式会随着外部刺激和发育线索的改变而发生动态变化。染色质可及性重构对于基因表达调控至关重要,在建立和维持细胞特性等方面发挥着重要作用。因此开展染色质可及性的研究对染色质功能上的三维解析具有十分重要的意义。近几年,随着高通量测序技术的进步以及测序成本的降低,基于高通量测序技术的染色质可及性分析方法得到了迅速发展。目前观察和分析全基因组染色质开放与否的常见技术主要有脱氧核糖核酸酶I超敏位点测序(DNase-seq)、微球菌核酸酶测序(MNase-seq)、甲醛辅助分离调控元件测序(FAIRE-seq)以及转座酶可及性测序(ATAC-seq)。本文比较了这4种染色质可及性分析技术的优缺点,详细介绍了它们的原理及主要实验流程,并简要讨论了它们的发展及相关技术的应用,期望通过这些互补的方法为染色质分析领域的未来发展提供一些借鉴和思路。

衰老细胞染色质开放变化的初步分析

为研究复制性衰老中表观遗传学的变化,以年轻代龄(PD26)和年老代龄(PD55)的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)为材料,进行ATAC-seq测序,并使用Bowtie2、FastQC、MACS、deepTools、phastCons、R语言、HOMER以及基因本体论(Gene Ontology,GO)对测序结果进行深入分析和挖掘。结果显示,2BS细胞染色质开放区域的保守性较强,其主要集中于启动子(promoter)区至转录起始位点(transcription start site,TSS),且年轻细胞与年老细胞的启动子区至转录起始位点的开放程度不同,细胞随着衰老在启动子区至转录起始位点的开放程度逐渐下降。进一步对年轻和年老细胞之间存在显著差异的靶基因进行GO分析发现,这些差异基因主要与细胞进程、代谢、生物性调节、结合功能、催化功能相关。本次研究发现衰老过程中染色质开放区减少、转录调控水平下降,提示复制性衰老与转录调控关系密切。

肝癌细胞系PLC/PRF/5中染色质重塑蛋白ATRX表达的调控作用

目的探讨肝癌细胞中地中海贫血伴精神发育迟滞综合征基因(ATRX)对基因表达的影响及其可能机制。方法利用CRISPR/Cas9技术敲除PLC/PRF/5细胞中的ATRX。全转录组测序技术(RNA-seq)检测ATRX敲除前后的基因表达水平,并用DESeq2软件得出差异表达基因。最后利用转座酶可及性核染色质区域分析技术(ATAC-seq)对差异基因的染色质可及性进行分析。结果分析得到2754个差异表达基因,其中MUC16和CXCL8均在ATRX缺失后表达显著上调(P<0.05),且两基因附近都存在升高的染色质可及性的区域。结论在肝癌细胞中,ATRX调控大量基因的表达,且可能直接参与了MUC16与CXCL8的抑制,为进一步研究ATRX在肝癌发生中的作用提供了新的线索。

植物基因组学中的流式细胞分析及分选技术

流式细胞术是一种高通量技术,可以同时快速检测单个颗粒物的多项物理及生物学特征。随着测序成本的大幅降低,流式细胞术在植物基因组学高通量样品获取中的作用日益凸显。该文以水稻(Oryza sativa)和大豆(Glycine max)为例,详细介绍了应用流式细胞术对植物细胞核进行精细分选以及后续的ATAC-seq和RNA-seq实验分析流程,为农业生物育种中基因的高效挖掘提供了优选工具。同时针对实验操作中的关键技术和常见问题,如细胞核制备注意事项、分选纯度与效率的平衡及单细胞分选调试方法进行分析并提出建议,为植物科学工作者应用流式细胞术开展基因组学研究提供参考。

p53缺失引发精原干细胞多能状态转化过程中能量代谢的改变及调控机制

长期精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)有自发转化成多能性干细胞的潜力,推测与睾丸生殖细胞肿瘤的出现有关,尤其是p53缺失显著加剧SSCs的自发转化效率。能量代谢被证实与细胞多能性有强关联性。近期我们通过染色质可及性测序技术(Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughput sequencing, ATAC-seq)和转录组测序技术(RNAseq)比较了野生型和p53缺失(p53^(-/-))小鼠SSCs染色质可及性及基因表达谱差异,揭示了SMAD3是SSCs向多能性转化中的一个关键转录因子,并观察到p53缺失后多个与能量代谢相关基因发生显著表达变化。为进一步揭示p53在多能性和能量代谢调控中的串扰作用,本文探究p53缺失后SSCs向多能性状态转化的能量调节机制。通过ATAC-seq和RNA-seq比较野生型和p53^(-/-)小鼠SSCs的染色质可及性和转录组差异,结果显示,p53缺失后,与糖酵解正调控和电子传递及ATP合成相关的基因染色质可及性增强;编码糖酵解关键酶和调控电子传递相关酶的基因转录水平升高;转录因子SMAD3、SMAD4的靶基因,编码AMPK亚基的Prkag2染色质可及性增强且转录水平升高。以上结果提示,p53缺失激活了SSCs糖酵解关键酶基因,正调控糖酵解基因的染色质可及性增强,以提高糖酵解活性,促进向多能性转化;SMAD3/SMAD4介导的Prkag2基因转录促进AMPK进行能量稳态的调控,维持细胞能量稳态。这一结果对干细胞多能性转化及生殖腺肿瘤的临床防治具有一定的参考意义。

染色质可及性与植物基因表达调控

真核生物基因组上的核小体呈现不均匀分布,转录活跃区域的染色质结构相对松散且易被调节蛋白结合,这些区域的可接近程度称为染色质可及性。随着测序技术的发展,DNase-seq、ATAC-seq、MNase-seq和NOMe-seq等组学技术的应用,全基因组范围内染色质可及性检测变得简便且高效。该文主要介绍了真核生物染色质可及性的4种基本检测方法的技术原理,总结了核小体定位、组蛋白修饰以及转录因子结合与染色质可及性的关系,并综述了染色质可及性参与植物生长发育和环境响应研究进展,以期为植物领域全基因组水平染色质可及性研究、顺式调控元件挖掘及发育和环境响应过程中基因表达调控网络的解析提供借鉴。

染色质转座酶可及性测序及其在木本植物中的应用前景

染色质转座酶可及性测序(assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing,ATAC-seq)是2013年在人类免疫细胞中建立的用于研究表观遗传调控的重要技术。该技术已在人类及小鼠等模式动物的基因组调控元件鉴定、转录因子结合位点识别及转录调控机制的解析等研究领域发挥了重要作用。然而,ATAC-seq技术在植物领域中的研究应用还处于起步阶段,相关研究主要集中在拟南芥和水稻等模式植物中。笔者主要概述了ATAC-seq技术在植物中的应用,包括染色质可及性图谱绘制、抗逆机制解析、表观修饰鉴定及调控元件识别等领域的研究进展,并进一步阐述了ATAC-seq在木本植物中的应用潜力,以推动ATAC-seq技术在木本植物表观基因组学研究中的应用。