具有抑制大肠杆菌作用的乳酸菌的初步筛选及其益生潜能的研究

为了筛选出具有抑制致病性大肠杆菌作用的乳酸菌,本实验以大肠杆菌ATCC25922作为指示菌,抑菌实验采用牛津杯法。通过发酵上清液对大肠杆菌ATCC25922的抑菌实验,初步筛选出三株乳酸菌发酵上清液对大肠杆菌ATCC25922具有抑制作用,经过对16S rRNA基因进行系统发育分析,发现这三株乳杆菌均为嗜酸乳杆菌。随后又对这三株嗜酸乳杆菌进行了耐酸、耐胆盐及抗生素敏感性实验。结果表明:KLDS1.0901酸耐受性最强,而KLDS1.0902和KLDS1.1003与Lactobacillus acidophilus NCFM酸耐受性接近;对照菌株Lactobacillus acidophilus NCFM胆盐耐受能力最强,KLDS1.0901和KLDS1.1003与Lactobacillus acidophilus NCFM胆盐耐受能力差异不显著,KLDS1.0902胆盐耐受能力最弱;对于抗生素敏感性,三株嗜酸乳杆菌展现出类似的结果,对氨基糖苷类的抗生素展现出耐受;相比于KLDS1.0902,KLDS1.0901和KLDS1.1003有着更好的益生作用潜能,因此随后将对这两株菌在细胞和动物模型中对抗病原菌的作用进行进一步的研究。

基于生物素-亲和素放大的SPR传感器检测大肠杆菌研究

建立了一种基于表面等离子体共振(SPR)技术的大肠杆菌特异性快速检测方法。采用EDC/NHS将葡聚糖修饰的CM5芯片表面活化,通过亲和素固定生物素标记的二抗(羊抗兔IgG抗体),利用一抗(兔抗大肠杆菌ATCC25922单克隆抗体)和二抗反应,将兔抗大肠杆菌单克隆抗体固定在传感芯片表面。利用一抗和二抗的质量扩增效应和生物素-亲和素的多级放大效应,实现了对低浓度大肠杆菌ATCC25922的快速检测,提高了SPR传感器灵敏度。利用NaOH溶液对芯片再生,可对多个不同浓度样品进行检测,采用相对响应单位(RU)记录数据。本传感芯片对大肠杆菌ATCC25922响应的线性范围为1.5×102 CFU/mL～1.5×107 CFU/mL,检测限为1.5×102 CFU/mL,相关系数r为0.981 5。这种方法简便快捷,有望成为一种在线检测治病菌的有力手段。

大肠杆菌菌株ATCC 25922碱性磷酸酶的原核表达、纯化及其活性研究

使用常规PCR法以大肠杆菌菌株ATCC 25922基因组为模板,克隆到该菌株的碱性磷酸酶成熟肽基因,并将其构建到原核表达载体pET-30a（＋）的Bam HⅠ、XhoⅠ之间,获得重组表达载体pET-30a-EAP。并且我们将pET-30a-EAP转化到大肠杆菌RosettaTM（DE3）pLysS中,经IPTG诱导表达后,获得大小为52ku的目的蛋白EAP。经试验证明该蛋白以可溶形式为主。进而,高效表达的重组碱性磷酸酶经亲和层析法纯化后被用于活性鉴定。pNPP的显色反应与去磷酸化试验证实来自ATCC 25922的重组碱性磷酸酶具有催化磷酸单酯水解活性,而且酶热稳定性高、有效工作温度范围大,与其他蛋白融合表达时仍保持酶活性。以上研究结果为大肠杆菌菌株ATCC 25922碱性磷酸酶的规模化生产及在免疫酶技术领域中的应用提供了重要的参考依据。

水杨酸钠、氯霉素诱导和临床分离大肠杆菌的交叉耐药性研究

目的临床分留和诱导对以上菌株分别测喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类、大环内脂类、头孢菌素类、β-内酰胺类、氯霉素类等23种药物的交叉耐药性.方法将ATCC25922接种于含有2倍最小抑菌浓度(MIC)的氯霉素和氯霉素(含5μM水杨酸钠)营养肉汤中培养传代,可获得高耐药大肠杆菌氯霉素株(iCHL)和水杨-氯霉素株(iS-CHL).临床分离三株大肠杆菌(H1、H9、H10).结果iS-CHL株和分离株H10对17种六类药物有交叉耐药性,而iCHL株对氯霉素高度耐药,对其它不如以上4株显著.结论水杨酸钠可能激活了大肠杆菌多重外输泵而致多重耐药.

植物乳杆菌35对大肠杆菌在肠上皮细胞HT-29上黏附及刺激产生促炎细胞因子的影响

本论文采用肠上皮细胞模型HT-29细胞系研究8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性,并研究黏附性较强的菌株及其胞外多糖(Exopoly Saccharides,EPS)抑制大肠杆菌(E.coli ATCC25922)在HT-29细胞上黏附及刺激HT-29细胞产生炎性因子的作用。结果表明8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性差异较大:黏附性最强的植物乳杆菌35通过取代、竞争和排阻方式抑制大肠杆菌在HT-29细胞上黏附,抑制黏附率分别为30%、33%和59%,其EPS在作用浓度为500μg/mL时对大肠杆菌的抑制黏附率为32%。植物乳杆菌35可抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,通过取代、竞争、排阻方式抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,抑制率分别为3%、28%和40%;其EPS抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8具有浓度效应,浓度为500μg/mL时抑制率最高,为50%。而对于IL-10表达量的影响均不显著。结果表明植物乳杆菌35具有抑制大肠杆菌引起肠炎的潜在益生功能。