西农萨能奶山羊ATF4基因克隆及其功能初步研究

转录激活子4(activating transcription factor 4,ATF4)是ATF/cAMP应答元件结合蛋白,在反刍动物的生长发育起着关键作用。本研究旨在分析西农萨能奶山羊ATF4基因序列结构,通过siRNA技术干扰ATF4基因表达,初步探究其对奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢和乳蛋白合成的影响。为明确ATF4在西农萨能奶山羊不同组织的表达差异,采集西农萨能奶山羊不同泌乳时期乳腺组织,克隆得到ATF4基因的CDS区并进行生物信息学分析及组织表达谱分析。结果表明,克隆得到奶山羊ATF4基因CDS区,全长为1059 bp,其编码352个氨基酸,蛋白分子量为38.54524 ku,理论等电点为4.61,有35个丝氨酸磷酸化位点,为无跨膜结构的酸性蛋白质;西农萨能奶山羊ATF4蛋白的二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲、β-转角分别为39.77%、7.10%、51.14%和1.99%;ATF4与CEBPB、CEBPG、ATF3、FOSL2、ATF1、DDIT3、TRIB3、BTRC、CREB1、DISC 10个蛋白存在相互作用,与绵羊和牛的亲缘关系最近,同源性分别为97.45%和91.48%。组织表达谱分析结果表明,ATF4基因的表达量在瘤胃组织中最高,其次为肌肉。ATF4基因在泌乳前期表达水平最高,在泌乳盛期次之。干扰奶山羊乳腺上皮细胞ATF4基因表达,显著下调FASN、FABP3和BLG基因mRNA水平,上调PPARA、PPARG和LALBA基因mRNA水平。上述结果提示,ATF4基因可能参与奶山羊乳腺上皮细胞脂质代谢和乳蛋白合成过程。本研究为ATF4调控羊奶乳脂代谢和乳蛋白合成的分子机理提供了理论基础。

牦牛ATF4基因组织表达与雌性生殖器官中定位分析

旨在克隆牦牛转录激活因子4(ATF4)基因,并检测其在不同组织的表达及雌性生殖器官中定位分析,探索ATF4在母牦牛繁殖的影响.以牦牛为实验对象,利用RT-PCR克隆得到牦牛ATF4基因CDS序列,生物信息学分析牦牛CDS区,RT-qPCR检测ATF4基因在牦牛不同组织中的表达模式,免疫组化(IHC)分析ATF4蛋白在雌性生殖器官中定位.结果表明,获得到牦牛ATF4基因cDNA序列,编码区全长1 047 bp,编码348个氨基酸,ATF4蛋白属于酸性亲水不稳定蛋白.RT-qPCR显示,ATF4基因在检测的8个组织中均有表达,在子宫和卵巢的表达量显著高于其它组织(P<0.05);妊娠期子宫、卵巢和输卵管中ATF4基因的表达量显著高于空怀期(P<0.05).IHC显示ATF4蛋白主要在牦牛卵巢的颗粒细胞、卵泡液、输卵管黏膜上皮、子宫内膜和子宫基质细胞中表达.这些结果说明ATF4基因在动物进化中比较保守,组织表达广泛,并在子宫和卵巢高表达,可能在牦牛繁殖调控中发挥重要作用.

利用CRISPR/Cas9技术构建ATF4基因敲除的HepG2细胞株

目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立ATF4基因敲除的HepG2细胞株。方法:针对ATF4基因作用的功能区域,设计靶向ATF4基因Exon 1(外显子1)和Exon 2(外显子2)的两对gRNA。构建PX459-ATF4-gRNA重组质粒并转化DH5α感受态细胞,筛选出重组子后进行测序,通过测序验证所设计的gRNA的有效性。将PX459-ATF4-gRNA质粒转染到HepG2细胞中,挑选单克隆细胞,提取DNA,进行PCR检测与基因测序,获得敲除ATF4基因的细胞株。通过western blotting检测筛选出来的HepG2细胞ATF4基因的敲除效果。结果:菌落PCR与菌液测序结果显示PX459-ATF4-gRNA载体构建成功;PCR扩增电泳与基因测序检测显示成功构建成了ATF4基因敲除的HepG2细胞;western blotting检测结果显示单克隆2号ATF4蛋白不表达,单克隆3号仍表达ATF4蛋白。结论:成功构建ATF4基因敲除的HepG2细胞,为后续ATF4在肝癌中的作用机制和功能研究奠定基础。

三穗鸭ATF4基因多态性鉴定及其与蛋壳品质的关联分析

【目的】探讨三穗鸭转录激活子4基因(ATF4)多态性与蛋壳品质的相关性,揭示禽类ATF4的生物学功能及其遗传特性,为进一步研究蛋壳品质的调控机制打下基础。【方法】以三穗鸭为研究对象,经PCR扩增获得ATF4基因后采用直接测序法检查三穗鸭ATF4基因全部编码区的变异位点,运用SHEsis计算基因型频率、等位基因频率、单倍型频率及基因型分布卡方值(c2)等,利用PopGen32计算各SNP位点的观察杂合度(He)、有效等位基因(Ne)及多态信息量(PIC),并以SPSS 18.0中的一般线性模型(GLM)分析SNP位点对蛋壳品质的遗传效应。【结果】在三穗鸭ATF4基因第3外显子(Exon-3)上发现3个SNPs位点(g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G),均属于同义突变。3个SNPs位点在三穗鸭群体中均呈中度多态性(0.25<PIC<0.50),其基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡,联合产生4种单倍型和9种双倍型。关联分析结果表明,g.2571A>G位点对三穗鸭蛋重和蛋壳重的影响达显著水平(P<0.05,下同),g.2667A>G位点对蛋壳厚度的影响达显著水平,g.2394G>A位点对蛋壳品质性状指标的影响不显著(P>0.05);双倍型H2H2(AAGGGG)的蛋壳厚度、蛋壳强度和蛋形指数均最高,是对三穗鸭蛋壳品质最有利的基因型,且3个SNPs位点共同对蛋壳品质的影响效应明显大于单个SNP位点。【结论】三穗鸭ATF4基因存在3个SNPs位点(g.2394G>A、g.2571 A>G和g.2667A>G),均属于同义突变,其中g.2571A>G和g.2667A>G位点对蛋壳品质有显著影响,3个SNPs位点组合基因型对蛋壳品质也产生显著影响,可作为鸭蛋蛋壳品质选择的分子遗传标记。

活化转录因子4基因敲除小鼠完全缺失晶状体致小眼症

旨在研究活化转录因子4(ATF4)基因敲除对小鼠眼睛发育的影响。将小鼠分为野生型(WT)组和ATF4敲除(KO)组,采用器官大体观察和组织病理学分析,明确ATF4基因敲除后对小鼠眼睛发育的影响。结果发现,WT小鼠眼球大小及组织结构正常。而ATF4^-/-小鼠眼球体积缩小;脉络膜和视网膜层层次结构基本存在,各个层次结构紊乱;神经节细胞层细胞数基本正常,约2层细胞,但细胞排列不整齐;内丛状层结构疏松,厚度增加;外核层细胞层次增加,超过10层,同时结构松散、形成裂隙和囊样结构;内核层细胞层次减少、约6层~8层细胞,细胞排列轻度紊乱。整个视网膜在局部形成乳头状突起;脉络膜基本正常,但没有乳头状的睫状突形成。眼球内玻璃体缺失,由水肿的纤维结缔组织构成,中央可见多个小血管。总之,ATF4^-/-小鼠展示了小眼表型,同时ATF4^-/-小鼠眼睛结构异常。