内质网应激中GRP78和ATF4-CHOP-Puma信号通路与帕金森病的关系及其治疗靶点的研究进展

内质网是真核细胞中重要的细胞器之一,与维持细胞稳态关系密切。当缺乏葡萄糖、缺氧、体内钙平衡紊乱或者发生氧化应激时,会引起细胞内未折叠蛋白或错误折叠蛋白的积累,导致内质网应激。帕金森病是一种慢性进行性脑变性疾病,典型的病理变化是黑质纹状体多巴胺能神经细胞变性丢失导致的多巴胺神经递质缺乏。目前对帕金森病的治疗多为缓解症状,但不能阻止疾病的进展。通过对内质网应激中的信号通路的研究发现:在帕金森病的发病过程中,多巴胺能神经元的选择性死亡与内质网应激有关。内质网应激过程中的中心调节因子:葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)及其下游ATF4-CHOP-Puma信号通路与帕金森病的发病过程有密切的联系,本文对GRP78及其下游ATF4-CHOP-Puma信号通路近些年来的研究进展进行综述,以期为帕金森病的治疗提供新的靶点和思路。

雷公藤红素通过调控ATF4/caspase-3/GSDME信号通路促进肝癌细胞焦亡

目的探究雷公藤红素(tripterine,TRI)抑制肝癌细胞(hepatocellular carcinoma,HCC)进展的新机制。方法利用不同浓度(0、0.5、2和8μmol·L-1)TRI作用于肝癌细胞,然后利用CCK-8、细胞克隆、Transwell和蛋白免疫印迹等实验方法评估细胞表型和可能机制;再利用siRNA将靶基因GSDME进行干扰,确定GSDME的作用;最后使用移植肿瘤模型验证TRI在体内抑制HCC细胞的生长的机制。结果TRI可抑制HCC细胞增殖、克隆和侵袭,促进细胞焦亡。免疫印迹结果显示,TRI处理后肝细胞癌HepG2或Hepa1-6中GSDME表达均上调,同时cleaved caspase-3和PARP也明显升高。敲除GSDME后可部分逆转TRI诱导的细胞焦亡。同时GSDME敲低后的细胞具有更强的克隆和迁移能力,且与单独的TRI治疗组相比,细胞凋亡率降低。在体内实验中,TRI抑制可HCC肿瘤生长,TRI+siGSDME组小鼠肿瘤生长速度比单独TRI治疗组快。此外,TRI刺激后HepG2和Hepa1-6细胞中p-eIF2a、ATF4均升高。免疫荧光结果显示,TRI刺激后HepG2和Hepa1-6细胞中ATF4阳性细胞数呈剂量依赖性增加。结论TRI抑制肝癌细胞生长和侵袭可能与其调控ATF4/caspase-3/GSDME信号通路促进肝癌细胞焦亡有关。

基于内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病大鼠足细胞凋亡的影响

目的:基于蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路探讨丹参多酚酸盐对膜性肾病(MN)大鼠内质网应激的影响。方法:将80只雄性SD大鼠随机分配,其中20只为正常组,剩余60只大鼠采用尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)的方法诱导MN病变。将造模成功的大鼠随机分为模型组、贝那普利组和丹参多酚酸盐低、中、高剂量组,每组10只,另取10只正常组大鼠共同进行实验。贝那普利组每日给药剂量为10 mg/kg,丹参多酚酸盐低、中、高剂量组每日给药剂量分别为16.7、33.3、66.7 mg/kg,正常组和模型组予等体积生理盐水,各组均每日灌胃1次,连续4周。检测各组大鼠治疗后24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);腹主动脉取血分离血清,检测各组大鼠血尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)含量;过碘酸六胺银(PASM)染色后光镜观察各组大鼠肾组织病理形态,透射电子显微镜进一步观察各组大鼠肾组织细微结构变化;免疫荧光法检测各组大鼠肾组织免疫球蛋白G(IgG)沉积情况;免疫组化(IHC)法检测各组大鼠肾组织足细胞裂隙膜蛋白(Podocin)、足细胞裂孔隔膜蛋白(Nephrin)表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测各组大鼠肾组织PERK、ATF4、CHOP、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)表达。结果:相较于正常组,模型组大鼠的肾组织显示出显著的病理性变化,肾小球基底膜显著增厚,并出现类似钉突的结构改变,同时伴有系膜基质的增生现象,沿毛细血管袢有IgG弥漫性沉积;各给药组大鼠肾组织上述病理改变有所缓解,足细胞损伤减少,IgG沉积减轻。模型组大鼠24 h-UTP水平显著高于正常组(P<0.01);各给药组大鼠24 h-UTP水平均显著低于模型组(P<0.05,P<0.01),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠24 h-UTP水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠24 h-UTP水平明显低于贝那普利组(P<0.01),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠24 h-UTP水平的降低作用具有明显的剂量依赖性(P<0.01)。各组大鼠血清BUN、Scr水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠肾组织Podocin、Nephrin蛋白表达显著低于正常组(P<0.05);各给药组大鼠上述蛋白表达均显著高于模型组(P<0.05),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠上述蛋白表达水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠上述蛋白表达水平明显高于贝那普利组(P<0.05),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠上述蛋白表达水平的升高作用具有明显的剂量依赖性(P<0.05)。模型组大鼠肾组织PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白表达水平均明显高于正常组(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显低于正常组(P<0.01);各给药组大鼠肾组织上述蛋白表达水平均较模型组显著改善(P<0.05,P<0.01),其中丹参多酚酸盐中剂量组大鼠上述蛋白表达水平与贝那普利组比较差异无统计学意义(P>0.05),丹参多酚酸盐高剂量组大鼠上述蛋白表达的改善程度显著优于贝那普利组(P<0.01),丹参多酚酸盐对MN模型大鼠上述蛋白表达水平的改善作用具有明显的剂量依赖性(P<0.01)。结论:丹参多酚酸盐可能通过调控PERK/ATF4/CHOP信号通路,缓解肾组织内质网应激,抑制足细胞凋亡,进而保护肾脏及延缓疾病进展。

基于PERK/ATF4/CHOP信号通路研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导的ARPE-19细胞的作用机制

目的研究滋阴明目方含药血清对衣霉素诱导ARPE-19细胞的影响及其可能机制。方法构建细胞内质网应激损伤模型,将ARPE-19细胞分为空白组、模型组、空白血清组、滋阴明目方含药血清组、牛磺熊去氧胆酸组。对细胞进行形态观察,CCK-8检测细胞存活率,TUNEL法检测细胞凋亡,Western blot检测细胞蛋白激酶样内质网激酶(PERK)、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白的表达。结果选用浓度50μmol/L衣霉素干预ARPE-19细胞造模。观察细胞形态发现,滋阴明目方含药血清组和牛磺熊去氧胆酸组ARPE-19细胞较模型组细胞数量增多,生长较均匀,漂浮的死亡ARPE-19细胞及碎片减少。与空白组相比,模型组和空白血清组的细胞存活率下降(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达上调(P<0.01)。与模型组相比,滋阴明目方含药血清组细胞存活率上升(P<0.01),凋亡率明显下降(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP蛋白表达下调(P<0.01)。结论滋阴明目方含药血清可以减少ARPE-19细胞内质网应激损伤模型的凋亡,其分子机制与调控PERK-ATF4-CHOP信号通路有关。

葛根芩连汤对2型糖尿病db/db小鼠胰腺组织PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察葛根芩连汤对2型糖尿病(T2DM)小鼠胰腺内质网应激的影响,探讨其治疗T2DM的作用机制。方法75只SPF级雄性db/db小鼠随机分为模型组、二甲双胍组和葛根芩连汤高、中、低剂量组,每组15只,15只db/m小鼠作为空白组,给药组分别予相应药物灌胃12周。检测小鼠体质量、空腹血糖(FBG)及糖化血红蛋白(HbA1c),HE染色观察胰腺组织病理变化,TUNEL染色检测胰岛细胞凋亡情况,Western blot检测胰腺组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、活化转录因子4(ATF4)、C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白表达,实时荧光定量PCR检测胰腺组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达。结果与空白组比较,模型组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著增加(P<0.01);胰腺组织结构不完整,边界模糊,内有空泡,胰岛细胞凋亡明显增加(P<0.01);胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著升高(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,各给药组小鼠体质量、FBG和HbA1c含量显著减少(P<0.05,P<0.01);胰腺组织病理改变有所减轻,胰岛细胞凋亡不同程度减少(P<0.05,P<0.01);葛根芩连汤高、中剂量组和二甲双胍组胰腺组织GRP78、p-PERK、ATF4、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.01),PERK、ATF4、CHOP mRNA表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论葛根芩连汤可能通过抑制内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路,下调相关基因和蛋白表达,减少胰岛细胞凋亡,保护胰岛细胞功能,延缓T2DM进展。

FABP4沉默通过调节PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路对妊娠糖尿病大鼠内质网应激和胰岛素抵抗的影响

目的:探讨脂肪酸结合蛋白4(FABP4)沉默通过调节蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核细胞启动因子2α(eIF2α)/转录因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路对妊娠糖尿病(GDM)大鼠内质网应激(ERS)和胰岛素抵抗(IR)的影响。方法:腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立GDM大鼠模型。通过尾静脉注射FABP4 siRNA质粒(si-FABP4)、阴性对照质粒(NC)和PERK激活剂(CCT020312),将大鼠随机分为Normal组、GDM组、GDM+NC组、GDM+si-FABP4组、GDM+si-FABP4+CCT020312组。检测胰腺组织中FABP4含量、血脂水平、炎症标志物水平和氧化应激标志物水平,检测胰腺组织中PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。HTR-8/SVneo细胞分为5组:对照(Control)组、高糖(HG)组、HG+NC组、HG+si-FABP4组、HG+si-FABP4+CCT020312组,24 h后检测细胞中FABP4及PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路相关蛋白表达。结果:与Normal组相比,GDM组大鼠血清和胰腺组织中FABP4水平显著上调(P<0.05)。FABP4沉默显著降低了FBG和IR,并伴有血脂、CRP、TNF-α、IL-6及MDA水平降低和SOD、CAT水平升高(P<0.05)。此外,FABP4沉默减轻了胰腺和胎盘组织损伤。而CCT020312上调PERK、eIF2α磷酸化水平和ATF4、CHOP蛋白表达后,FABP4沉默对GDM大鼠IR、炎症、氧化应激以及胰腺和胎盘损伤的抑制作用均被逆转(P<0.05)。FABP4在HG诱导的HTR-8/SVneo细胞中上调表达,沉默FABP4可抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路蛋白表达,CCT020312则逆转这种变化(P<0.05)。结论:FABP4沉默通过抑制炎症和氧化应激,改善GDM大鼠的IR和ERS,其机制与抑制PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路有关。

降脂通脉饮对高血脂症大鼠血脂和PERK/ATF4/CHOP信号通路的影响

目的观察降脂通脉饮对高血脂症大鼠血脂及蛋白激酶样内质网激酶(PERK)/转录激活因子4(ATF4)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路的影响,探讨降脂通脉饮调节血脂的作用机制。方法将30只SD大鼠随机分为正常组、模型组及降脂通脉饮低、中、高剂量组,每组6只。正常组大鼠给予普通饲料喂养,同时灌胃生理盐水;其余组大鼠给予高脂饲料喂养,其中模型组同时灌胃生理盐水,降脂通脉饮低、中、高剂量组同时灌胃1.56 mg/(kg·d)、3.125 mg/(kg·d)、6.25 mg/(kg·d)的降脂通脉饮。连续干预8周后,生化法检测血清胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,RT-PCR和Western blot法检测颈动脉组织中PERK、ATF4、CHOPmRNA及蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平和PERK、ATF4、CHOP mRNA及蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05);与模型组比较,降脂通脉饮中、高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平和PERK、ATF4、CHOP mRNA及蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。结论降脂通脉饮可能通过调节内质网应激PERK/ATF4/CHOP信号通路而发挥降脂作用。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

基于PERK/ATF4信号通路探讨保元汤对慢性心力衰竭模型大鼠的影响

【目的】观察保元汤对慢性心力衰竭模型大鼠的治疗作用及机制。【方法】将SD大鼠随机分为空白组、模型组、保元汤组、卡托普利组、保元汤+CCT020312[蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)激活剂]组,每组15只。除空白组,其他各组大鼠采用阿霉素诱导构建慢性心力衰竭模型。给予相应的药物干预后,检测各组大鼠心功能指标[左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)及脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)],炎症相关因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)],氧化应激因子[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)],细胞凋亡相关指标[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)、半胱天冬酶3(Caspase-3)]及PERK/转录激活因子4(ATF4)信号通路相关蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、PERK、ATF4、C/EBP同源蛋白(CHOP)水平变化。【结果】与空白组比较,模型组大鼠LVEDD,BNP、cTnI,TNF-α、IL-1β,MDA水平,Bax、Caspase-3,GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著升高,LVEF、LVFS,SOD及Bcl-2蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)。与模型组和保元汤+CCT020312组比较,保元汤组、卡托普利组大鼠LVEDD,BNP、cTnI,TNF-α、IL-1β,MDA水平,Bax、Caspase-3,GRP78、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著降低,LVEF、LVFS,SOD及Bcl-2蛋白表达水平显著升高(均P<0.05)。与卡托普利组比较,保元汤组大鼠上述指标(除CHOP蛋白表达水平外)均无显著变化(P>0.05)。【结论】保元汤可以延缓慢性心力衰竭大鼠进展,其机制可能与抑制PERK/ATF4信号传导通路缓解心肌细胞凋亡,进而减轻炎症反应和氧化应激程度,从而促进心功能及心肌损伤的修复有关。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨四味黄芪散对高原低氧致脑损伤大鼠的保护作用及机制

目的基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路探讨四味黄芪散(藏黄芪、藏红花、川芎、沉香)对高原低氧致脑损伤大鼠的保护作用及机制。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组、阳性药物组(诺迪康,0.125 g·kg^(-1)·d-1)以及四味黄芪散低、中、高剂量组(3.255、6.510、13.020 g·kg^(-1)·d-1),每组10只。四味黄芪散各剂量组灌胃给药,每日1次,连续14 d;阳性药物组给予诺迪康灌胃给药,每日1次,连续给药7 d。采用实验动物低压模拟舱复制高原低氧致脑损伤大鼠模型,低氧暴露持续7 d。采用HE染色法观察大鼠脑组织病理变化;TUNEL染色法检测大鼠脑组织细胞凋亡情况;TBA法、微板法分别检测脑组织中丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的水平;Western Blot法检测大鼠脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平;RT-qPCR法检测大鼠脑组织中PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达水平。结果与空白组比较,模型组大鼠海马CA1区锥体细胞水肿,排列不规则,胞质疏松淡染;海马CA1区红色荧光强度显著增强(P<0.01);脑组织中MDA含量显著升高(P<0.01),GSH活性显著降低(P<0.01);脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著升高(P<0.01),PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,阳性药物组及四味黄芪散高、中、低剂量组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密,边界较清,细胞水肿得到改善;海马CA1区的红色荧光强度明显减弱(P<0.05);脑组织中MDA含量显著降低(P<0.01),GSH活性显著升高(P<0.05,P<0.01)。四味黄芪散高、中剂量组大鼠脑组织中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),PERK、eIF2α、ATF4、CHOP mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01);四味黄芪散低剂量组大鼠脑组织中p-eIF2α/eIF2α、CHOP蛋白表达水平显著降低(P<0.05,P<0.01),eIF2α、CHOP mRNA表达显著下调(P<0.05,P<0.01)。结论四味黄芪散能改善高原低氧致脑损伤大鼠的脑组织神经元细胞水肿,增强抗氧化应激能力,减少脑组织细胞凋亡,可能与其调控PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路抑制内质网应激有关。

GCN2/ATF4/BNIP3通路介导线粒体自噬对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响

探究GCN2 /ATF4 /BNIP3通路介导线粒体自噬对子宫内膜癌细胞增殖活性的影响。方法 人子宫内膜癌细胞株Ishikawa为研究对象,随机分为四组,A组:为对照,不做任何干预,B 组:线粒体诱导(10μM CCCP)、C组:线粒体诱导+GCN2过表达(10μM CCCP+GCN2慢病毒转染), D组:线粒体诱导组线粒体诱导+GCN2-siRNA(10μM CCCP+GCN2-siRNA转染)。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,qRT-PCR和Western blot分别检测GCN2、ATF4、BNIP3、LC3、PINK1的表达水平的变化。结果 与A组相比,B组在24h、48h和72h各时间点增殖活力均明显减少(P<0.05),与B组相比,C组在各时间点增殖活力均明显增加(P<0.05),D组在各时间点增殖活力均明显减少(P<0.05)。Western blot和qRT-PCR检测结果显示,与A组相比,B组细胞LC3、PINK1蛋白和mRNA均明显增加(P<0.05),GCN2、ATF4、BNIP3蛋白和mRNA表达无明显差异(P<0.05),与B组相比,C组GCN2、ATF4、BNIP3蛋白和mRNA表达均明显增加(P<0.05),LC3、PINK1蛋白和mRNA表达均明显下降(P<0.05),D组(P<0.05),GCN2、ATF4、BNIP3蛋白和mRNA表达均明显下降(P<0.05),LC3、PINK1蛋白和mRNA表达均明显增加(P<0.05)。结论 抑制GCN2 /ATF4 /BNIP3通路可通过激活线粒体自噬抑制子宫内膜癌细胞增殖。

猪ATF4基因多态性与生产性状的关联及基因表达分析

为进一步了解和认识ATF4基因的功能,揭示ATF4对猪脂肪代谢的影响,寻找与肉质性状相关联的分子标记,文章采用PCR方法扩增了ATF4基因部分序列,通过序列比对发现在翻译起始密码子ATG下游159 bp处存在A159G转换,通过PCR-AluⅠ-RFLP对大白猪、长白猪、梅山猪和通城猪进行酶切分型,发现在大白猪和长白猪中均为AA基因型,在梅山猪和通城猪中均为GG基因型。进一步对大白猪×梅山F2群体资源家系进行了酶切分型,并分析该位点的多态性与生产性状的关系。结果表明,ATF4的多态性与臀部平均膘厚存在极显著相关(P<0.01),与胸腰椎间膘厚、平均膘厚、眼肌高、眼肌面积存在显著相关(P<0.05)。采用Real-time PCR分析了ATF4基因在大白猪与梅山猪背最长肌不同发育阶段的表达模式。结果表明,ATF4基因在大白猪和梅山猪胚胎期65 d和出生后3 d中的表达水平相对都比较低,且在两品种间无明显差异;而在出生后60 d和120 d,ATF4基因在大白猪中与梅山猪均出现了上调表达,并且在梅山猪中的相对表达水平要显著高于大白猪。研究结果为进一步深入研究猪ATF4基因在脂肪代谢中的分子机理奠定了基础。

益气除痰方调控内质网应激蛋白ATF4、CHOP治疗肺癌机理研究

目的:从内质网应激角度探讨益气除痰方治疗脾虚型肺癌的作用机制。方法:建立脾虚Lewis肺癌小鼠模型,随机分为模型组(生理盐水),化疗组(生理盐水+顺铂注射液1 mg/kg),益气除痰方低、中、高剂量组(2、4、8 g/kg),联合用药组(益气除痰方4 g/kg+顺铂注射液1 mg/kg),每组8只。每3 d测量小鼠体重和瘤体大小,14 d后处死小鼠,称量瘤重、计算肺表面转移结节数,免疫组织化学法、RT-q PCR法检测肿瘤组织中ATF4、CHOP表达。结果:与模型组比较,益气除痰方中、高剂量组均能明显抑制移植瘤生长,减少肺转移结节数,提高肺转移抑制率(P<0.01或P<0.05);并能明显上调内质网应激蛋白ATF4、CHOP表达,其中联合用药组效果最好(P<0.01)。与化疗组比较,联合用药组ATF4、CHOP表达明显升高(P<0.05)。结论:益气除痰方可能通过上调内质网应激蛋白ATF4、CHOP的表达介导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。

小檗碱通过PERK-ATF4通路对高糖诱导的血管平滑肌细胞钙化的改善作用

目的 基于内质网应激(ERS)蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-激活转录因子4(ATF4)通路探讨小檗碱减轻高糖诱导的血管平滑肌细胞(VSMC)钙化的相关机制。方法 体外培养大鼠VSMC细胞,分为对照组,高糖组(35 mmol/L葡萄糖),小檗碱低、中、高剂量组(35 mmol/L葡萄糖+50、100、200μmol/L小檗碱),小檗碱+pcDNA组(35 mmol/L葡萄糖+200μmol/L小檗碱+转染pcDNA),小檗碱+pcDNA-ATF4组(35 mmol/L葡萄糖+200μmol/L小檗碱+转染pcDNA-ATF4)。RT-qPCR法检测ATF4 mRNA表达,甲基百里香酚蓝比色法检测钙水平,磷酸苯二钠法检测ALP活性,Western blot法检测p-PERK、PERK、ATF4、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2(Runx2)、Osterix蛋白表达。结果 与对照组比较,高糖组VSMC细胞钙水平、ALP活性及细胞中p-PERK/PERK、ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达升高(P<0.05);与高糖组比较,小檗碱各剂量组以上指标均降低(P<0.05),并呈剂量依赖性;与小檗碱+pcDNA组比较,小檗碱+pcDNA-ATF4组钙水平、ALP活性及细胞中ATF4、OPN、Runx2、Osterix蛋白表达及ATF4 mRNA表达均升高(P<0.05)。结论 小檗碱能减轻高糖诱导的VSMC细胞钙化,其机制可能与抑制PERK-ATF4通路的激活有关。

不同运动对2型糖尿病小鼠骨中cAMP/CREB/Atf4途径及骨形成的影响

目的:探讨2型糖尿病(T2DM)小鼠骨形成变化及不同运动对T2DM小鼠骨中环磷酸腺苷(c AMP)/环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)/激活转录因子4(ATF4)途径和骨形成的影响。方法:40只4周龄C57BL/6雄性小鼠,适应性喂养1周后随机分为正常对照组(ZC,10只)和T2DM造模组(30只)。T2DM造模组小鼠造模成功后随机分为T2DM对照组(TC组,9只)、T2DM游泳组(TS组,9只)和T2DM下坡跑组(TD组,9只)。利用游泳和下坡跑对TS组和TD组小鼠进行8周训练。结束后,取小鼠血清并利用ELISA法检测c AMP浓度;取右侧股骨并利用RT-PCR法检测CREB、ATF4、骨钙素(OC)、骨钙蛋白(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的m RNA表达;取右侧胫骨并利用West-blotting法检测CREB蛋白表达;取小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)并诱导其向骨细胞(OB)分化,利用碱性磷酸酶(ALP)染液对OB染色;取左侧股骨并用Micro-CT对股骨远端BMD进行扫描。结果:与ZC组相比,TC组c AMP浓度下降,CREB、ATF4、OC、OCN和BSP m RNA及CREB蛋白表达均显著下降(P<0.05或P<0.01),OB成骨能力和BMD显著下降(P<0.01)。与TC组相比,TS组OC和OCN m RNA表达上调(P<0.05或P<0.01),OB骨形成能力增强;TD组c AMP浓度下降,CREB、ATF4、OC和OCN m RNA及CREB蛋白表达均显著上调(P<0.05或P<0.01),OB骨形成能力和BMD显著增加(P<0.01)。与TS组相比,TD组c AMP浓度升高,CREB、ATF4和OC的m RNA表达显著上调(P<0.05或P<0.01),OB骨形成能力增强。结论:2型糖尿病小鼠骨形成代谢被抑制;下坡跑通过激活2型糖尿病小鼠骨中c AMP/CREB/ATF4途径,促进成骨细胞分化及骨形成能力,提高骨密度,且其作用效果优于游泳。

清热化淤方对脑缺血预处理大鼠ATF4、Caspase-12表达的影响

目的观察清热化淤方对脑缺血预处理大鼠缺血再灌注后ATF4、Caspase-12 mRNA及其蛋白表达的影响。方法SD大鼠160只,随机分为假手术组(SO)、脑缺血再灌注组(MCAO)、脑缺血预处理组(BIP)、清热化淤方干预组(QRHY)四组,每组按照再缺血后12h、1d、2d、3d四个时间点分为4个亚组。采用二次线栓法制备大鼠局灶性脑缺血预处理模型,用原位杂交法和Western blot法观察再缺血后各个时间点ATF4、Caspase-12 mRNA及其蛋白的表达变化。结果①MCAO组12h ATF4mRNA及其蛋白表达均达高峰(P<0.01),随再灌注时间延长其表达逐渐下降;BIP组较MCAO组ATF4mRNA及其蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01);QRHY组较BIP组进一步降低其表达(P<0.05,P<0.01)。②MCAO组12 h Caspase-12 mRNA及其蛋白表达均达高峰,随再灌注时间延长其表达逐渐下降(P<0.01);BIP组较MCAO组Caspase-12mRNA及其蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01);QRHY组较BIP组进一步降低其表达(P<0.05,P<0.01)。结论清热化淤方可通过下调大鼠脑缺血预处理后ATF4、Caspase-12表达发挥其神经保护作用。

ATF4在SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌中的表达及与长期随访结果的关系

目的探讨转录激活因子4(activating transcription factor 4,ATF4)的表达与SiewertⅡ型食管胃结合部腺癌(adenocarcinoma of esophagogastric junction,AEG)患者临床病理特征及预后的关系。方法回顾性收集行R0切除的80例SiewertⅡ型AEG患者的临床病理资料,采用免疫组化SP法检测SiewertⅡ型AEG及对应癌旁组织中ATF4的表达情况,观察患者临床特征、生存情况,并通过Cox风险比例模型分析其与预后的关系。结果ATF4在SiewertⅡ型AEG中的阳性表达率为28.8%(23/80),显著低于癌旁组织的87.5%(70/80),差异有统计学意义(P<0.001)。此外,ATF4的表达与AEG的分化程度、TNM分期及淋巴结转移均有明显的相关性(P<0.05)。80例患者的中位随访时间为120个月(95%CI:108.542~131.458)。Kaplan-Meier生存分析显示,ATF4表达阳性的患者长期生存明显优于阴性的患者(P<0.001)。单因素分析显示TNM分期(HR=2.082,95%CI:1.065~4.070,P=0.032)和ATF4的表达(HR=0.214,95%CI:0.096~0.480,P<0.001)可能是患者总生存期的影响因素。进一步多因素分析结果显示ATF4(HR=0.156,95%CI:0.057~0.428,P<0.001)可作为AEG患者的独立预后因子。结论ATF4可能在AEG的发生、发展过程中发挥重要作用,未来有望成为SiewertⅡ型AEG患者远期预后判断的新的生物标志物。

ATF4在顺铂致肝癌细胞HepG2凋亡中的作用

目的探讨ATF4在顺铂诱导的肝癌细胞HepG2凋亡中的变化,并对其作用进行初步研究。方法人肝癌细胞Hep G2经不同浓度顺铂处理24和48 h后,MTS法检测细胞活力;Western blot检测内质网应激反应及凋亡相关蛋白(Bip、ATF4、PARP、activated-Caspase3、CHOP)表达的变化;使用siRNA干扰技术沉默ATF4的表达,并观察沉默ATF4蛋白表达后,肝癌细胞对顺铂敏感性的变化;利用Annexin V-FITC和PI双标法,在倒置荧光显微镜中检测细胞凋亡情况。平板克隆形成实验用于判断单个细胞克隆生长速度。结果与溶剂对照组相比,顺铂明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡;时间和浓度依赖性地引起内质网应激反应相关蛋白CHOP、ATF4表达水平上调,但不影响Bip的蛋白表达;同时导致activated-Caspase3的活化,引起PARP蛋白的切割。使用siRNA沉默ATF4的蛋白表达后,能部分逆转顺铂引起的细胞凋亡以及克隆形成抑制。结论顺铂可以通过上调ATF4的表达,触发内质网反应,从而诱导肝癌细胞凋亡。

ATF4基因在绵羊胚胎附植期子宫中的表达模式研究

【目的】探讨激活转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)在绵羊胚胎附植期子宫中的表达变化规律和在胚胎附植过程中发挥的作用。【方法】利用妊娠第9、13、17、21、25天怀孕与未孕母羊的子宫,应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对21d怀孕母羊全身组织及各时间点的怀孕与未孕母羊子宫组织进行表达研究。【结果】1半定量结果显示ATF4基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皱胃、输卵管、子宫颈、脑垂体、松果体、卵巢及子宫体等组织均有表达,但在子宫体、子宫颈及卵巢中表达量较高;2实时荧光定量PCR结果显示,怀孕绵羊胚胎从第9天开始,其ATF4表达量呈逐渐上升趋势,到第21天到达高峰,以后又开始下降,与同发情期的空怀母羊对照比较,怀孕母羊各时间点ATF4的表达量均显著高于未孕的同期母羊。【结论】ATF4基因在绵羊胚胎附植中起一定的作用。

多发性骨髓瘤细胞中Blimp1、ATF4和CHOP的表达及阿司匹林对其表达的影响

目的:探究多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓单个核细胞中Blimp1、ATF4因子和CHOP蛋白的表达及阿司匹林对其表达的影响及意义。方法:采用Ficoll分离液分离60例初诊未经治疗的多发性骨髓瘤患者和30例骨髓相对正常者骨髓液中的单个核细胞,免疫磁珠法分选CD138+的浆细胞并通过实时荧光定量PCR检测细胞中Blimp1,ATF4和CHOP mRNA表达水平。体外培养U266细胞,使用慢病毒感染细胞,采用实时荧光定量PCR检测不同分组细胞中Blimp1,ATF4和CHOP mRNA表达水平。用不同浓度的阿司匹林溶液(0、0.5、2.0和5.0mmol/L)体外分别刺激U266细胞24、48和72 h,采用CCK-8法检测阿司匹林对细胞的增殖活性的抑制作用。收集不同浓度的阿司匹林溶液刺激48 h后的U266骨髓细胞,实时荧光定量PCR检测各组细胞中Blimp1、ATF4和CHOP mRNA的表达水平。结果:与相对正常组浆细胞比较,MM患者CD138^+浆细胞中Blimp1 mRNA表达水平显著升高(8.040±1.878),ATF4和CHOP mRNA表达水平显著降低(0.735±0.089;0.837±0.062)(P<0.05)。体外培养U266细胞,相较空白对照组与阴性对照组,经LV-Blimp1-RNAi(40051-2)慢病毒表达载体感染后阳性实验组中Blimp mRNA的表达水平显著下调(0.637±0.021),ATF4和CHOP mRNA表达水平显著上调(1.452±0.027;1.721±0.038)(P<0.05)。CCK-8检测不同浓度阿司匹林刺激24、48和72 h后,U266细胞增殖活性降低,阿司匹林(0.5-5)mmol/L浓度范围内可显著抑制U266细胞的增殖活性,抑制作用随药物刺激时间的延长和刺激浓度的增加而增强(r24 h=0.986;r48 h=0.951;r72 h=0.954;r0.5=0.997;r2.5=0.997;r5.0=0.974)。不同浓度阿司匹林刺激48 h后,U266细胞中Blimp1 mRNA的表达水平随药物浓度升高而依次降低(r=-0.981),而ATF4和CHOP mRNA的表达水平随药物浓度升高而依次升高(rATF4=0.973;rCHOP=0.995)。结论:抑制多发性骨髓瘤细胞中Blimp1的表达,可促进ATF4和CHOP的表达。阿司匹林可通过下调骨髓瘤细胞中Blimp1表达和上调ATF4和CHOP的表达抑制骨髓瘤细胞的增殖活性,发挥抗肿瘤活性。