基于GRP78-ATF6-CHOP通路研究雷公藤多苷对坏死性小肠结肠炎新生大鼠的影响

目的:观察雷公藤对坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)新生大鼠的影响,并探讨其通过调控葡萄糖调节蛋白78(GRP78)—激活转录因子6(ATF6)—增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)通路发挥作用的。方法:采用缺氧+冷刺激法建立新生大鼠NEC模型,分为模型组、雷公藤多苷低剂量组(9 mg·kg^(-1))、雷公藤多苷中剂量组(18 mg·kg^(-1))、雷公藤多苷高剂量组(27 mg·kg^(-1)),另设对照组。检测粪便肠道菌群变化,肠组织病理学改变,肠组织中白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平及GRP78、ATF6、CHOP蛋白表达。结果:与模型组比较,雷公藤多苷低、中、高剂量组肠组织损伤评分、肠球菌总数、革兰氏阳性(G+)球菌比率、肠组织IL-1β和TNF-α水平及GRP78、ATF6、CHOP蛋白表达均明显降低(P<0.05),肠杆菌总数、杆/球菌比值、G+杆菌比率、肠组织IL-6水平均明显升高(P<0.05)。其中肠组织损伤评分、肠球菌总数、G+球菌比率、肠组织IL-1β和TNF-α水平及GRP78、ATF6、CHOP蛋白表达,雷公藤多苷低剂量组>中剂量组>高剂量组;肠杆菌总数、杆/球菌比值、G+杆菌比率、肠组织IL-6水平,雷公藤多苷低剂量组<中剂量组<高剂量组。结论:雷公藤多苷可改善NEC新生大鼠的肠道菌群紊乱现象,且可能通过抑制GRP78-ATF6-CHOP通路发挥肠道保护作用。

高血压伴高同型半胱氨酸血症大鼠心肌ATF6和CHOP表达对左室肥厚的影响及依叶片干预效果

目的研究高血压伴高同型半胱氨酸血症(HHcy)大鼠心肌内质网应激(ERS)时,激活作用转录因子6(ATF6)和C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达与左室肥厚的关系及依叶片对其干预效果。方法60只雄性SD大鼠行腹主动脉缩窄术(AAC),术后2周选收缩压(SBP)≥140 mm Hg(1 mm Hg=0.133k Pa)大鼠45只随机等分为3组。AAC组普通饲料喂养并双蒸水灌胃;对照组2.5%蛋氨酸饲料喂养并双蒸水灌胃;治疗组2.5%蛋氨酸饲料喂养并依叶片[10 mg/(kg·d)]灌胃。定期测SBP和血同型半胱氨酸(Hcy),查心脏彩超,并用免疫组化和Western blot法观察大鼠心肌ATF6和CHOP的表达。结果术后20周,对照组大鼠SBP,血Hcy,室间隔舒张厚度(IVSD)和左室厚壁舒张厚度(LVPWD),心肌ATF6和CHOP表达均高于AAC组(P<0.05);治疗组大鼠SBP,血Hcy,IVSD和LVPWD,心肌ATF6和CHOP表达均明显低于对照组(P<0.05)。结论高血压伴HHcy大鼠心肌ATF6及CHOP表达较Hcy正常的高血压大鼠明显增高,以凋亡因子CHOP表达更占优势;依叶片有效降压,降低血Hcy,减轻心肌ERS,减缓心肌肥厚的作用。

当归补血汤对糖尿病肾病大鼠肾组织ATF6、CHOP、Caspase-3表达的影响

目的观察当归补血汤对糖尿病肾病大鼠肾组织ATF6、CHOP、Caspase-3表达的影响,探讨其肾脏保护机制。方法 60只SD雄性大鼠随机分为对照组和造模组。造模组大鼠采用尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)结合高脂高糖饮食建立糖尿病肾病(DN)模型。造模成功的大鼠随机分为模型组、格列齐特组、当归补血汤高剂量组和低剂量组,每组10只。格列齐特组给予格列齐特缓释片2.68 mg·kg^(-1)·d^(-1),中药高、低剂量组分别给予当归补血汤7.14 mg·kg^(-1)·d^(-1)和1.78 mg·kg^(-1)·d^(-1),对照组和模型组给予等量0.9%Na Cl溶液,连续给药8周。Western blot和PCR分别检测各组大鼠肾组织活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、生长抑制DNA损伤基因153(C/EBP homologous protein,GADD153/CHOP)、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)的蛋白及mRNA表达水平。TUNEL染色检测各组大鼠肾组织阳性细胞凋亡率。结果与对照组相比,模型组ATF6、CHOP、Caspase-3 mRNA和蛋白表达均升高,TUNEL阳性细胞率增加(P<0.01)。与模型组相比,格列齐特组及当归补血汤高、低剂量组ATF6、CHOP、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平及TUNEL阳性细胞率显著降低(P<0.01)。当归补血汤高剂量组ATF6、CHOP、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平及TUNEL阳性细胞率显著低于格列齐特组和低剂量组(P<0.01)。结论当归补血汤能减少糖尿病肾病大鼠肾组织细胞凋亡,其机制可能与下调ATF6、CHOP、Caspase-3表达及抑制内质网应激有关。

肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠ATF6/CHOP通路的作用研究

目的观察肾衰饮对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏ATF6/CHOP通路的影响,探析肾衰饮延缓慢性肾功能衰竭的作用机制。方法 52只SD大鼠,按体质量分层随机抽取10只为正常组,其他大鼠采用腺嘌呤灌胃法模型3周。造模成功后随机分为模型组、肾衰饮组和尿毒清组。肾衰饮组和尿毒清组分别给予肾衰饮煎剂和尿毒清颗粒连续灌胃4周。全自动生化分析仪检测血肌酐、尿素氮含量,HE染色观察各组大鼠肾组织病理变化,Western Blot技术检测大鼠肾脏ATF6、CHOP、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组Scr、BUN水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,肾衰饮组和尿毒清组大鼠Scr、BUN水平均显著降低(P<0.01)。HE染色提示:肾衰饮及尿毒清能够改善模型组大鼠肾脏病理学改变。Western Blot结果提示:与正常组比较,模型组大鼠肾脏ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bcl-2/Bax水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,肾衰饮组大鼠ATF6、CHOP、Caspase-3蛋白表达水平显著降低(P<0.05或P<0.01),Bcl-2/Bax水平显著升高(P<0.01)。结论肾衰饮可能通过影响ATF6/CHOP通路,减少肾组织细胞凋亡,保护受损肾脏功能。

基于ATF6/CHOP通路的红芪多糖对糖尿病胃轻瘫大鼠胃窦组织平滑肌的影响

目的观察红芪多糖对糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠胃窦组织平滑肌的影响,从ATF6/CHOP信号通路探讨其作用机制。方法72只Wistar雄性大鼠随机分为空白组12只、造模组60只,造模组采用一次性腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg和高糖高脂饲料不规则喂食4周复制DGP模型。将成模大鼠随机分为模型组、二甲双胍组和红芪多糖高、中、低剂量组。红芪多糖高、中、低剂量组分别予红芪多糖药液200、100、50 mg/kg灌胃,二甲双胍组予二甲双胍药液200 mg/kg灌胃,每日1次,连续4周。每2周测定大鼠随机血糖,检测胃排空率,TUNEL染色检测胃窦组织平滑肌细胞凋亡率,Westernblot检测胃窦组织平滑肌葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、活化转录因子6(ATF6)、CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)表达,免疫组化染色检测胃窦组织平滑肌GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠第0、2、4周血糖升高,胃排空率降低;胃窦组织平滑肌细胞凋亡率升高,GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12、Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,红芪多糖高、中剂量组和二甲双胍组大鼠第2、4周血糖降低,胃排空率升高;胃窦组织平滑肌细胞凋亡率降低,GRP78、ATF6、CHOP、Caspase-12蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论红芪多糖可能通过抑制ATF6/CHOP通路相关蛋白表达减轻DGP模型大鼠胃窦组织平滑肌细胞凋亡,进而缓解DGP进展。

茵陈蒿汤对阻塞性黄疸大鼠肝细胞ATF6/GRP78/CHOP凋亡信号通路的影响

目的:探讨茵陈蒿汤对阻塞性黄疸大鼠肝细胞凋亡通路转录激活因子6(ATF6)、葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)及谷丙转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)的影响。方法:将正常大鼠肝细胞系(BRL-3A)分为胎牛血清配制的培养基培养的对照组(S组)、阻塞性黄疸血清配制的培养基培养的阻塞性黄疸组(O组)以及梗阻性黄疸血清+茵陈蒿汤含药血清配制的培养基培养的阻塞性黄疸+茵陈蒿汤组(Y组),分别于培养6、24、48 h后收集细胞。观察细胞形态且采用TUNEL法检测细胞凋亡情况,采用Western印迹和q-PCR法测定各组ATF6、GRP78及CHOP的蛋白及mRNA表达。采用ELISA法测定ALT、AST水平。结果:与S组相比,O组和Y组细胞各时间点均明显变小、变形和数量减少,凋亡指数明显升高,CHOP、ATF6和GRP78 mRNA及蛋白表达水平明显上调,上清液中AST、ALT含量均升高(F=29.75~154.3,均P<0.05);与O组相比较,Y组细胞状态在每个时间点均有显著改善,凋亡指数均下降,CHOP、ATF6和GRP78 mRNA及蛋白表达水平明显下调或趋于下调,上清液中AST、ALT含量均下降(F=29.75~154.3,均P<0.05)。结论:茵陈蒿汤可通过调控GRP78/ATF6/CHOP通路抑制细胞凋亡,减轻阻塞性黄疸引起的肝细胞损伤。

ATF6/CHOP信号通路对减毒牛结核分枝杆菌感染的THP-1细胞焦亡的调控作用

目的:探讨转录激活因子6(ATF6)/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路对牛分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)感染的THP-1细胞焦亡的调控作用。方法:在感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞2、6、12、24和48 h基础上,设置si-NC组、si-NC+BCG组、si-ATF6+BCG组及si-CHOP+BCG组。si-NC组转染干扰阴性对照24 h后正常培养;si-NC+BCG组先转染阴性对照24 h后以感染复数为10∶1的BCG感染24 h;si-ATF6+BCG组和si-CHOP+BCG组分别转染si-ATF6和si-CHOP 24 h后再用感染复数为10∶1的BCG感染24 h。采用Western blot检测cleaved ATF6、CHOP、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、pro-caspase-1、caspase-1 p20、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、IL-1βp17、IL-18 p22及消皮素D-N端片段(GSDMD-N)蛋白表达;采用免疫荧光检测GSDMD蛋白表达;采用CCK-8法检测细胞活力。结果:Western blot结果显示,BCG感染THP-1细胞后,cleaved ATF6和CHOP蛋白的表达随感染时间延长逐渐升高,48 h达到最高,而GSDMD-N蛋白在24 h表达最高(P<0.01)。与si-NC组相比,si-NC+BCG组的cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20、ASC、IL-1βp17、IL-18 p22及GSDMD-N蛋白表达显著上调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著增加(P<0.01),细胞活力显著下降(P<0.01);与si-NC+BCG组相比,si-ATF6+BCG组上述蛋白表达显著下调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著下降(P<0.01),细胞活力显著上升(P<0.01);与si-NC+BCG组相比,si-CHOP+BCG组上述蛋白表达显著下调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著下降(P<0.01),细胞活力显著上升(P<0.01)。结论:ATF6/CHOP信号通路对BCG感染的THP-1细胞焦亡具有调控作用。

甲基莲心碱对自发性高血压大鼠心脏重构影响及其机制研究

目的观察甲基莲心碱(neferine,NE)对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rats,SHRs)心脏重构的影响,并探讨其对活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)-C/EBP同源蛋白(CCAAT/Enhancer-binding Protein(C/EBP)Homologous Protein,CHOP)内质网应激(endoplasmic reticulum,ERs)信号通路的影响。方法48只大鼠喂养6个月后,然后随机分为4组:魏-凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto,WKYs)+溶媒、SHRs+溶媒、WKYs+NE和SHRs+NE(n=12)。WKYs+NE和SHRs+NE组用NE治疗,剂量为25 mg·kg^(-1)·d^(-1);WKYs+溶媒、SHR+溶媒组用溶媒治疗。持续治疗5个月后,通过超声心动图和组织学分析评估心功能和纤维化。采用实时定量PCR和免疫印迹法检测ATF6、CHOP基因和蛋白表达水平。采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡。结果与SHRs+vehicle组相比,NE治疗SHRs的血压升高逐渐降低,并且NE治疗SHRs可显著逆转心脏收缩和舒张功能不全(EF、FS和E/A比值降低)、心肌肥厚(心脏大小和HW/BW比值增加)、心肌细胞横截面积和心肌胶原沉积。qPCR和Western blot分析显示,NE治疗SHRs可显著减弱心脏组织中ATF6、CHOP mRNA水平以及蛋白水平。此外,与WKYs组相比,SHRs组大鼠心肌组织TUNEL阳性细胞明显增多,NE治疗SHRs可显著减弱心脏组织中TUNEL阳性细胞。结论NE可显著减轻SHRs心肌细胞凋亡和ERs,并改善SHRs的心脏重构,支持其作为高血压慢性治疗药物。

乔松素对内质网应激所致内皮细胞凋亡的抑制作用及机制

目的:探讨乔松素对内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)所致人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的抑制作用及其机制。方法:体外培养HUVECs,分别给予6. 25、12. 5和25 mg/L乔松素预处理1 h,再加入TM(10mg/L)继续培养24 h。分别采用MTT法和Annexin V-FITC/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞活力和细胞凋亡情况;采用试剂盒测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性,并采用Hoechst 33342/PI双染法检测细胞膜损伤情况;采用Western blot法检测ERS标志分子葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和ERS凋亡途径关键蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达情况,以及蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和真核翻译起始因子2α(eIF2α)的磷酸化水平;免疫荧光细胞化学法检测活化转录因子6(ATF6)的核转位情况。结果:乔松素(12. 5和25 mg/L)预处理显著抑制TM所诱导的细胞活力降低、LDH漏出、PI阳性细胞率和凋亡率增加(P<0. 05或P<0. 01)。TM显著上调GRP78和CHOP的蛋白表达水平,且促进其上游调控蛋白PERK和e IF2α磷酸化及ATF6核转位,而乔松素显著拮抗TM所致的上述变化,并呈剂量依赖性(P<0. 05或P<0. 01)。结论:乔松素可减轻ERS诱导的HUVECs凋亡,其机制可能与抑制ATF6/PERK-CHOP信号通路的活化有关。

4-苯基丁酸对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用及机制探讨

目的 以博来霉素(bleomycin,BLM)诱导的肺纤维化小鼠为模型,探讨4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid,4-PBA)在肺纤维化中的作用及其机制。方法 C57BL/6小鼠气管内注射BLM建立小鼠肺纤维化模型。将120只小鼠随机分为三组:BLM组、BLM+4-PBA组和对照组。对小鼠肺组织进行病理分析,比较小鼠存活率,检测内质网应激标志物感受器活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)在小鼠肺组织中的表达水平。结果 BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中胶原沉积明显,给予4-PBA后减轻了肺组织胶原沉积。与BLM组相比,在肺纤维化形成期维持2周的4-PBA治疗可明显改善小鼠肺功能,提高生存率。同时,4-PBA治疗显著降低了小鼠肺组织中ATF6和CHOP的mRNA及蛋白表达水平。结论 4-PBA可抑制内质网应激,从而减轻BLM诱导的小鼠肺纤维化。