ATG蛋白作用于自噬生物合成的研究进展

自噬是改善人类多种疾病状况的潜在治疗靶点,其起源于之前被称作吞噬泡的隔离膜,自噬相关蛋白ATG的协调作用使隔离膜扩张形成自噬体。自噬生物合成的方式和机制一直是一个长期存在的问题,本文对ATG蛋白作用于自噬生物合成的研究进展作一综述。

植物ATG8结合蛋白

ATG8(自噬相关蛋白8)结合蛋白通过ATG8相互作用基序(ATG8 interaction motif,AIM)或泛素相互作用基序(ubiquitin interaction motif,UIM)与ATG8相互作用,在自噬、选择性自噬和非自噬过程中起关键作用。ATG8结合蛋白在酵母和哺乳动物研究中取得了巨大进展,但在植物领域仍然滞后。本文首先概括了植物ATG8蛋白结构及特征,其次,重点阐述了作为植物选择性自噬受体的ATG8结合蛋白的结构和功能,最后,总结了参与自噬小体闭合、转运和人工合成ATG8结合蛋白研究状况。本文结合最新研究,系统总结了目前发现的植物ATG8结合蛋白结构和功能,以期为植物选择性自噬和自噬的研究提供新思路。

半胱氨酸蛋白酶CfAtg4在油茶果生刺盘孢中的功能分析

[目的]揭示半胱氨酸蛋白酶CfAtg4在油茶果生刺盘孢中的生物学功能,为油茶炭疽病新型防控药剂的开发提供候选靶标位点。[方法]通过Overlap PCR构建CfATG4基因敲除片段,利用同源重组原理和PEG介导的原生质体转化法获得敲除突变体和回补菌株;测定野生型、突变体、回补菌株对自噬诱导剂雷帕霉素的敏感性,通过倒置荧光显微镜观察饥饿诱导前后自噬小体数量评价自噬发生程度,采用蛋白免疫印迹试验验证显微观察结果;测定野生型、突变体、回补菌株的生长速率、分生孢子产量、致病力、孢子萌发、附着胞形成以及对外界胁迫敏感性。[结果]1)果生刺盘孢CfATG4基因敲除突变体ΔCfatg4对雷帕霉素更敏感,自噬小体数量显著少于野生型,ΔCfatg4突变体饥饿诱导前后均不能降解自噬标记蛋白GFP-CfAtg8,自噬作用丧失。2)通过生物学表型分析发现,突变体ΔCfatg4在不同营养条件培养基上生长速率减缓,气生菌丝减少;ΔCfatg4突变体产孢量显著减少,在油茶叶片上致病性丧失,且无法穿透玻璃纸。3)突变体ΔCfatg4孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。4)突变体ΔCfatg4对盐胁迫(NaCl、KCl)更耐受,对细胞壁完整性胁迫剂SDS更敏感,对CR更耐受;突变体ΔCfatg4在氧化环境(H_(2)O_(2))下更敏感,在还原环境(DTT)下更耐受。[结论]半胱氨酸蛋白酶CfAtg4介导的自噬参与调控油茶果生刺盘孢生长发育、产孢、附着胞形成、外界胁迫应答和致病过程。

miR-17在动脉粥样硬化中下调ATG7蛋白水平抑制巨噬细胞的自噬功能

目的在动脉粥样硬化患者的血液中检测自噬相关miRNA的水平变化,探究差异miRNA是否参与巨噬细胞的自噬过程,并影响巨噬细胞的凋亡及炎症表达。方法在动脉粥样硬化患者的血液中,用荧光定量PCR的方法检测miRNA的水平。在转染miR-17后,通过蛋白质免疫印迹的方法检测巨噬细胞中ATG7蛋白以及自噬标志物LC3Ⅱ表达。同时,使用MTT实验检测转染miR-17后双氧水诱导巨噬细胞凋亡的改变,通过荧光定量PCR检测炎性因子水平探究转染miR-17后巨噬细胞的炎症表达。结果在动脉粥样硬化患者的血液中,miR-17的水平特异升高。而转染miR-17后,巨噬细胞中miR-17靶向蛋白ATG7和自噬标志物LC3Ⅱ表达下降。miR-17在巨噬细胞中的升高同时促进了双氧水诱导的细胞凋亡,并增强了TNF-α等炎性因子的表达。结论 miR-17水平在动脉粥样硬化患者的血液中特异升高,并在巨噬细胞通过靶向ATG7介导细胞自噬水平降低,进而增强巨噬细胞的炎症表达并促进其凋亡。

BmATG5蛋白作为分子开关调控家蚕细胞自噬和凋亡关系的研究进展

细胞自噬（autophagy）和凋亡（apoptosis）是昆虫蜕皮与变态发育过程中细胞死亡最主要的2种方式。家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目的模式昆虫之一,有关细胞自噬和凋亡的研究也比较深入,包括细胞自噬和凋亡的形态特征、诱导信号和通路、对蚕体发育的影响、自噬相关蛋白的鉴定和功能等。前期研究揭示家蚕自噬相关蛋白Bm ATG5和Bm ATG6具有自噬与凋亡的分子开关功能,但它们调控细胞凋亡的具体机制至今不详。本文在简要综述昆虫及家蚕细胞自噬和凋亡研究的基础上,重点介绍了Bm ATG5调控细胞凋亡分子机制研究的最新进展,为深入揭示Bm ATG5的分子调控功能,以及其应用于鳞翅目害虫防治和家蚕变态发育调控的研究提供参考依据。

人自噬相关蛋白ATG7的原核表达及纯化鉴定

目的:原核表达并纯化自噬相关蛋白ATG7,初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG7基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)得到重组质粒,经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate菌株进行小量诱导,纯化融合蛋白His-ATG7,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约2031 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)后构建出His-ATG7重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;转化大肠杆菌Rossate并进行小量诱导,纯化后SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为78×103的融合蛋白。结论:纯化得到原核系统表达的His-ATG7融合蛋白,为后续研究ATG7在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

RNA结合蛋白ZFP36在心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用及调控机制

目的探讨RNA结合锌指蛋白36(ZFP36)在缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤和自噬中的作用及分子调控机制。方法H9C2大鼠心肌细胞感染ZFP36过表达慢病毒(OE-ZFP36)或其阴性对照慢病毒(OE-ZFP36 NC)构建稳转细胞株;转染ATG4D过表达质粒(OE-ATG4D)提高ATG4D表达。H/R处理诱导心肌细胞损伤;将H9C2细胞分为对照组、H/R组、OE-ZFP36 NC+H/R组、OE-ZFP36+H/R组、OE-ATG4D NC+H/R组、OE-ATG4D+H/R组、OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组和OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组。各组细胞应用Western blotting检测ATG4D、Beclin1、LC3和ZFP36蛋白表达;实时荧光定量PCR(qPCR)检测ZFP36和ATG4D mRNA表达;CCK-8检测细胞活性;酶联免疫吸附法(ELISA)检测白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平;SOD试剂盒检测SOD水平;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞免疫荧光检测LC3自噬体;双荧光素酶报告基因实验检测ZFP36和ATG4D mRNA的结合。结果与对照组比较,H/R组中细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平提高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加;ATG4D、Beclin1蛋白表达上调,同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著增加;且ZFP36表达上调(P<0.05)。与OE-ZFP36 NC+H/R组比较,OE-ZFP36+H/R组中细胞活性提高,IL-6和TNF-α水平降低,ROS水平下降而SOD水平升高,细胞凋亡减少,且ATG4D、Beclin1蛋白表达下调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也显著下调(P<0.05)。与感染OE-ZFP36 NC慢病毒比较,感染OE-ZFP36慢病毒降低ATG4D 3′-UTR报告基因的荧光素酶活性,降低ATG4D mRNA稳定性,下调H/R诱导的ATG4D mRNA表达(P<0.05)。与OE-ATG4D NC+H/R组相比,OE-ATG4D+H/R组中的ATG4D mRNA和蛋白表达显著上调,且细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平增高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加(P<0.05)。与OE-ZFP36+OE-ATG4D NC+H/R组比较,OE-ZFP36+OE-ATG4D+H/R组中细胞活性降低,IL-6和TNF-α水平增高,ROS水平升高而SOD水平降低,细胞凋亡增加(P<0.05)。结论ZFP36在H/R诱导的心肌细胞损伤中表达上调,过表达ZFP36抑制了H/R诱导的心肌细胞损伤,并通过调控ATG4D抑制自噬,进而抵抗心肌细胞H/R损伤,证明ZFP36是抵抗心肌缺血再灌注损伤的重要调控分子。

家蚕感染BmCPV后中肠自噬相关蛋白ATG8的表达变化

家蚕质型多角体病毒（BmCPV）感染家蚕幼虫中肠上皮细胞而引起中肠型脓病,对病毒致病机理的研究有助于制定科学的预防策略。细胞自噬作为机体的一种免疫机制在抵抗微生物的感染中发挥作用。利用免疫组织化学法,检测BmCPV感染家蚕4龄幼虫中肠组织中的细胞自噬相关蛋白ATG8（autophagy-related gene 8）的表达变化：家蚕幼虫在感染BmCPV1-8 h内,中肠ATG8蛋白的表达显著高于正常水平;感染8-35 h,中肠ATP8蛋白的表达下降至正常水平;感染51 h,该蛋白质在中肠的表达又显著升高,至99 h达到高峰,且感染后62 h可以观察到中肠上皮层柱状细胞内有病毒多角体的产生。研究结果显示BmCPV感染家蚕幼虫的过程与中肠细胞自噬存在一定的关系。

EGFR和自噬相关蛋白Atg5、p62在宫颈癌中的表达及意义研究

目的分析表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR)和自噬相关蛋白Atg5、p62在宫颈癌患者中的表达,探讨其与临床病理及预后因素的关系。方法收集2014年6月至2018年2月收治的80例经病理学证实为宫颈癌患者的组织标本及其癌旁正常组织标本,同时收集上述患者伴有盆腔淋巴结转移组织标本45例。比较宫颈癌组织、转移淋巴结组织和正常组织中EGFR、Atg5、p62表达情况和以上指标与宫颈癌患者临床病理特征及生存情况的关系。结果EGFR、p62在宫颈癌组织转移淋巴结组织中表达率均明显高于癌旁正常组织(P<0.05),Atg5在宫颈癌组织中和转移淋巴结组织中表达率分别为21.25%、33.33%,明显低于正常组织(P<0.05)。EGFR表达阳性率与宫颈癌临床病理参数均无相关性(P>0.05)。Atg5、p62在不同年龄及肿瘤直径中的表达差异无统计学意义(P>0.05),p62表达随肿瘤分化程度升高而降低,不同分化程度间差异有统计学意义(P<0.05),Atg5在不同肿瘤分化程度间差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ+Ⅳ期和有淋巴结转移患者中的Atg5表达分别低于Ⅰ+Ⅱ期组和无淋巴转移组(P<0.05),而p62的表达与之相反。Spearman相关分析显示,宫颈癌组织中Atg5和p62的表达呈明显负相关(r=-0.656,P<0.01),EGFR与Atg5和p62无相关性(P>0.05);在转移淋巴结组织中,Atg5和p62的表达呈负相关(r=-0.562,P<0.01),EGFR与Atg5和p62无明显相关性(P>0.05)。80例患者随访3年死亡22例,3年生存率为72.50%(58/80),宫颈癌组织中EGFR及p62高表达者3年生存率分别低于EGFR及p62低表达者,而Atg5高表达者3年生存率高于低表达者(P<0.05)。Cox比例风险模型分析显示:TNM分期、淋巴结转移、EGFR、p62为宫颈癌预后的独立危险因素,Atg5为保护因素。结论EGFR、p62在宫颈癌组织及淋巴结转移组织中呈高表达,而Atg5呈低表达,三者可作为宫颈癌患者预后独立预测因素,此外,Atg5及p62与宫颈癌生物学行为有关,可能成为宫颈癌诊断的潜在指标。

自噬相关蛋白Atg14在碘难治性分化型甲状腺癌的 表达 及临床意义

目的自噬相关蛋白Atg14在碘难治性分化型甲状腺癌(RAIR-DTC)中的作用报道较少。文中旨在探讨自噬相关蛋白Atg14在RAIR-DTC的诊断价值。方法回顾性收集2013年1月至2019年12月广西医科大学第一附属医院核医学科72例行甲状腺癌手术治疗的DTC患者。根据治疗效果分为RAIR-DTC组(碘难治患者,n=37)和NRAIR-DTC组(非碘难治患者,n=35)。采用免疫组化方法检测癌组织中Atg14的表达,并分析其表达量与患者血清刺激性甲状腺球蛋白(sTg)、影像学T/B及临床病理特征的关系。结果^(131)I治疗前,RAIR-DTC组癌组织中Atg14相对表达量(0.079±0.020)较NRAIR-DTC组(0.034±0.006)明显升高(P=0.001)。ROC曲线分析结果显示:Atg14的AUC为0.995,诊断阈值为0.047,灵敏性为94.6%,特异性为100%,95%CI:0.987-1.000(P<0.01)。两次^(131)I治疗前,与NRAIR-DTC组血清学sTg水平相比,RAIR-DTC组更高(P<0.05)。RAIR-DTC组sTg同比下降率分别为(0.114±0.759)和(0.900±0.191),明显低于NRAIR-DTC组(P<0.05)。两次^(131)I治疗后,RAIR-DTC组T1/T2均高于NRAIR-DTC组(P<0.05)。结论Atg14在RAIR-DTC癌组织中高表达,其可能成为RAIR-DTC的诊断标志物之一。

人自噬相关蛋白ATG5的原核表达及纯化

目的:原核表达纯化带His标签的自噬相关蛋白ATG5。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG5基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)中得到重组质粒,经Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Ros-sate进行小量诱导,挑选出可以诱导His-ATG5蛋白的菌液进行融合蛋白的纯化,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约828 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)构建出His-ATG5重组质粒并经酶切及测序验证;转化大肠杆菌Rossate后进行小量诱导表达并纯化蛋白,SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为38×103的融合蛋白。结论:原核表达并纯化获得His-ATG5融合蛋白,为后续研究ATG5在自噬中的作用机制奠定了实验基础。

高度特异性小麦ATG8抗体的研制及其在细胞自噬检测中的应用

细胞自噬是一种进化上高度保守的溶酶体/液泡降解途径,对机体适应各种生物或非生物胁迫,以及维持自身正常生长发育具有重要的意义。自噬相关蛋白8(autophagy-related protein 8,ATG8)是检测自噬的金标准。目前由于缺乏特异性好的小麦ATG8抗体,导致小麦细胞自噬研究进展缓慢。本研究通过人工合成小麦ATG8蛋白序列上的一段18个氨基酸的多肽作为抗原去免疫兔子,成功获得了高度特异性的小麦ATG8多克隆抗体。该抗体不仅能够识别小麦根、叶及种子中的ATG8蛋白条带,而且可以在根、叶中检测到细胞自噬结构,并首次在小麦籽粒中实现了细胞自噬结构的检测。本研究研制的小麦ATG8抗体,除了能够检测到小麦中常见的ATG8a-h等8种典型类型外,还能检测到一种非典型的新的ATG8蛋白,为深入开展植物细胞自噬调控机制研究以及优异新基因挖掘提供了最佳方法学基础。

miR-145a-3p通过靶向ATG14调控布鲁氏菌诱导的RAW264.7自噬

【目的】探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞(RAW264.7)自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物(miR-145a-3p mimics)和抑制剂(miR-145a-3p inhibitor)及对照模拟物(NC mimics),转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因(autophagy-related gene 14,ATG14)的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3′UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3′UTR和PmirGLO-ATG14-3′UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3′UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低(P<0.01)。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低(P<0.01)、ATG14蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调(P<0.01);布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高(P<0.01),且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组(P<0.05)。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低(P<0.05)。【结论】miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。

COPⅡ囊泡衣被蛋白SEC24A在巨自噬通路中的功能研究

细胞自噬是一种重要且保守的细胞内降解过程,通过形成双层膜的自噬体包裹细胞内容物进行降解。内质网来源的COPⅡ囊泡被认为是饥饿诱导的应激过程中自噬体的膜源。探究了COPⅡ囊泡衣被蛋白SEC24A在巨自噬通路中的作用。利用siRNA干扰技术敲低SEC24A的表达,EBSS饥饿处理对照组和SEC24A敲低组HeLa细胞2 h诱导自噬发生,经Western blot和免疫荧光实验检测自噬底物蛋白p62和自噬标志蛋白LC3-Ⅱ的蛋白水平变化,以确定SEC24A是否参与自噬。通过RFP-GFP-LC3串联荧光检测自噬体和自噬溶酶体的数目,利用蛋白酶K保护实验验证自噬缺陷发生在自噬体闭合之前或者之后,利用免疫荧光实验检测敲低SEC24A对自噬通路上ATG复合物的影响,以确定SEC24A调控自噬通路的位点。通过免疫共沉淀实验验证SEC24A与自噬相关蛋白ATG9A是否存在相互作用。蛋白检测实验发现,饥饿条件下与对照细胞相比,敲低SEC24A细胞内自噬底物蛋白p62积累,而标志蛋白LC3-Ⅱ减少。RFP-GFP-LC3串联荧光实验显示,敲低SEC24A后自噬体及自噬溶酶体的数目均减少。蛋白酶K保护实验显示,SEC24A敲低细胞中受膜结构保护的p62和GFP-LC3均减少,提示SEC24A作用位点在自噬体闭合之前。免疫荧光实验显示,敲低SEC24A的表达后ATG14L、ATG16L1点状结构减少,而ATG9A点状结构的数量没有明显变化,提示SEC24A作用于ATG14L、ATG16L1上游。免疫共沉淀实验显示SEC24A与ATG9A存在相互作用。研究结果不仅有助于深化对自噬体形成过程和分子机制的了解,也为全面解读COPⅡ囊泡及其衣被蛋白在自噬中的重要作用提供了信息。

自噬相关蛋白在2型糖尿病大鼠胰腺组织中的变化

目的通过动物实验探讨细胞自噬与糖尿病的可能相关性。方法将6只SPF级雄性SD大鼠适应性喂养3 d,随机分成正常组和模型组;正常组喂以常规饲料,模型组给予高糖高脂饲料,喂养4周;4周后隔夜空腹给予模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,1周后再次腹腔注射30 mg/kg,正常组注射相应体积的生理盐水。模型组STZ注射4周后大鼠禁食,剪尾取血,测量空腹血糖(FBG),FBG>7.8 mmol/L为糖尿病诊断标准。模型构建成功后处死正常组和模型组,取胰腺组织采用蛋白免疫印迹法检测自噬基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关蛋白7(Atg7)和自噬相关蛋白Beclin-1和P62蛋白(sequestosome-1蛋白)表达水平,采用免疫组织化学法检测LC3和Beclin-1蛋白表达量。结果与正常组相比,WB法检测提示模型组大鼠胰腺组织LC3、Atg7和Beclin-1表达量增加(t=-39.984,-39.049,-59.157,P均<0.01),P62蛋白表达水平较正常组明显降低(t=90.466,P<0.01),免疫组织化学法检测提示LC3和Beclin-1蛋白表达量均增加(t=14.561,7.342,P均<0.01)。结论细胞自噬功能的紊乱可能导致糖尿病的发生。

微小RNA-20a对宫颈癌细胞迁移、侵袭、增殖及ATG7表达的影响

目的探讨微小RNA-20a(miR-20a)对宫颈癌Si Ha细胞迁移、侵袭和增殖的影响及可能机制。方法采用Lipofectamine 2000脂质体法将miR-20a抑制剂和阴性对照载体分别转染Si Ha细胞株。采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测两组细胞中miR-20a的表达以验证转染效果,细胞迁移实验、Transwell细胞侵袭实验及MTT法分别检测miR-20a的表达抑制对Si Ha细胞迁移、侵袭和增殖的影响;荧光素酶报告实验及Western blotting验证miR-20a对下游预测靶基因自噬相关蛋白7(ATG7)的调控作用。结果 QPCR检测结果显示,与阴性对照组比较,miR-20a抑制剂组Si Ha细胞中miR-20a的表达量显著降低(P<0.01),证明转染模型构建成功。细胞迁移实验显示,转染48 h后,阴性对照组细胞的划痕愈合率为(75.68±5.94)%,高于抑制剂组的(38.24±7.68)%(P<0.01)。Transwell细胞侵袭实验显示,转染48 h后,阴性对照组穿膜细胞数为(96.35±10.23)个,多于抑制剂组的(23.54±7.26)个(P<0.01)。MTT法检测显示,阴性对照组和抑制剂组细胞增殖能力的差异无统计学意义(P>0.05)。与阴性对照组相比,转染miR-20a模拟物+ATG7野生型3’UTR报告基因载体的细胞荧光素酶活性显著下降(P<0.01),而转染miR-20a模拟物+ATG7突变型3’UTR报告基因载体的细胞荧光素酶活性无显著变化(P>0.05);Western blotting检测显示,与阴性对照组比较,抑制剂组细胞ATG7蛋白表达量显著增加(P<0.01)。结论降低miR-20a的表达能显著抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力,但细胞增殖能力不受影响,这可能与miR-20a直接作用于其下游靶基因ATG7并调控其表达紧密相关。

牛源ATG13的克隆表达及功能分析

细胞自噬是细胞的一种自我保护机制。本研究选取牛源autophagy related gene 13(ATG13)为研究对象,通过分子生物学方法,对ATG13蛋白进行了鉴定与分析。原核表达及Westenblot鉴定发现,ATG13基因编码的蛋白大小为53k D左右。研究结果为研究牛源ATG13蛋白的生理功能及调控机制积累了前期实验数据,同时为生物医学与生物材料学领域中进一步开发利用牛源ATG13蛋白奠定了基础。

自噬标志分子ATG8同源蛋白的生物信息

自噬是细胞重要的代谢途径,ATG8在自噬体形成过程中起着重要的作用。对ATG8蛋白进行生物信息学分析研究十分必要。本研究以NCBI中人ATG8同源蛋白序列数据为研究材料,分析其与10种模式生物间基因拷贝数、氨基酸序列、蛋白质保守位点相关性。结果表明,人6种ATG8同源蛋白分别定位于5条染色体上,均有泛素样GABARAP结构域。并且,所有模式生物的ATG8同源蛋白中N-端氨基酸序列保守性强于C-端序列。本研究构建的ATG8同源蛋白系统发育树显示,人的ATG8同源蛋白与脊椎动物(斑马鱼,爪蟾,小鼠,大鼠,牛)的ATG8蛋白亲缘关系更近,人的GABARAPs与酵母的ATG8蛋白与的亲缘关系较近。本研究为研究细胞自噬过程及机制提供了丰富的生物进化和生物信息数据支持。

氟达拉滨联合后置环磷酰胺用于单倍体造血干细胞移植临床疗效分析

目的:探讨氟达拉滨(Flu)联合后置环磷酰胺(CTX)预防单倍体造血干细胞移植中移植物抗宿主病(GVHD)的治疗方法。方法:29例患者接受常规BUCY-ATG预处理方案。52例患者接受PTCy(Flu+BUCY+后置CTX预处理)方案(CTX 50 mg/kg,+3 d及+4 d)。结果:中位随访时间为359 d,所有患者在第+30,+60天短串联重复序列(STR DNA)检测达到完全供体嵌合。PTCy组和BUCY-ATG组中性粒细胞计数≥0.5×10^(9)/L和血小板计数≥20×10^(9)/L的中位时间分别为(11.5 vs.12)d和(12 vs.13)d,Ⅱ~Ⅳ度急性GVHD(aGVHD)、Ⅲ~Ⅳ度aGVHD和慢性GVHD的累计发生率分别为(30.8%vs.31%)、(19.2%vs.24.1%)和(5.8%vs.24.1%)。累计总生存率(OS)和无病生存率(DFS)为65.5%vs.62.1%,1年时的非复发死亡率(NRM)为75%和77%。巨细胞病毒(CMV)感染和EB病毒(EBV)感染的发生率分别为(48.3%vs.50%)和(6.9%vs.3.7%)。结论:在缺乏HLA配型相合同胞供者和非亲缘全和供者的情况下,后置CTX的单倍体造血干细胞移植不失为一种较好的选择。但移植后的复发和感染仍然是影响患者长期存活的不良因素,寻找合适的移植方案仍然是当务之急。

白纹伊蚊自噬基因ATG8蛋白多克隆抗体的制备及应用

目的通过原核表达系统制备白纹伊蚊(Aedes albopictus,Aa)ATG8,免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,并验证抗体的实用性。方法从白纹伊蚊Aa23细胞中提取cDNA,通过PCR扩增AaATG8基因片段,然后与载体pET30a连接,构建原核表达载体pET30a-AaATG8并转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞,挑取单克隆进行PCR鉴定,提取质粒进行测序鉴定。再将重组质粒转化到大肠埃希菌BL21感受态细胞,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白rAa-ATG8,纯化透析后免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA检测抗体效价,并以该抗体为一抗采用Western blot检测不同物种ATG8蛋白的表达。结果成功构建原核表达载体PET30a-AaATG8并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,ELISA检测其血清抗体效价为1∶640000;Western blot显示rAa-ATG8多克隆抗体可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,反应条带位于18、16或14 ku处。结论成功获得高效价的rAa-ATG8多克隆抗体,该抗体不仅可用于检测白纹伊蚊ATG8蛋白,还可用于检测埃及伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、家蝇ATG8蛋白,为研究自噬在蚊虫以及其他物种中的作用奠定了基础。