牛ATG10基因的克隆、原核表达、纯化和生物信息学分析

为了获得牛自噬相关基因10(ATG10)蛋白,试验参照GenBank中牛ATG10基因设计引物,PCR扩增ATG10基因,与pET-N-His-TEV载体连接,测序鉴定正确后用IPTG诱导ATG10蛋白表达,利用Ni-TED琼脂糖树脂进行蛋白纯化,Western-blot鉴定ATG10蛋白表达情况,通过生物信息学在线软件对ATG10蛋白进行分析,获得其相应的理化性质及参数。结果表明:克隆得到的ATG10基因序列长度约为705 bp,测序鉴定正确后得到pET-N-His-TEV-ATG10原核表达载体,IPTG成功诱导表达了ATG10蛋白,分子量为28 ku;ATG10蛋白与兔抗ATG10抗体特异性结合;ATG10蛋白是一种较为稳定的、含38个潜在的磷酸化位点、无跨膜区及信号肽的亲水性蛋白,二级结构中无规则卷曲占比44.44%,与ATG5、ATG12、ATG16L1、ATG3等多个自噬相关蛋白相互作用。说明试验成功构建出pET-N-His-TEV-ATG10原核表达载体,并获得ATG10蛋白。

大黄鱼ATG10基因的分子特征及其在抗病毒免疫中的功能

为了研究自噬相关基因ATG10(Autophagy related gene 10)在鱼类免疫应答中的功能,研究克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)ATG10基因(LcATG10)的cDNA序列,其开放阅读框全长747个核苷酸,编码248个氨基酸的蛋白,包含1个Autophagy_act_C结构域。系统进化分析显示,LcATG10和其他硬骨鱼类ATG10聚成一支,与金头鲷和石斑鱼ATG10亲缘关系最近。LcATG10在所检测的正常大黄鱼各组织中都有表达。在病毒类似物poly(I:C)刺激后,大黄鱼脾脏和头肾组织中LcATG10的表达水平显著上调,分别在12h和6h达到峰值(9.4和5.9倍)。LcATG10在大黄鱼头肾细胞系(LYCK)、原代巨噬细胞、淋巴细胞和粒细胞中也均有表达,在原代粒细胞中的表达量相对较高;在poly(I:C)刺激后,大黄鱼原代头肾粒细胞和LYCK细胞中LcATG10的表达水平显著上调。过表达LcATG10的鲤上皮瘤(Epithelioma papulosum cyprinid,EPC)细胞受鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)感染48h后,细胞病变效应(Cytopathic effects,CPEs)明显低于对照组;细胞培养上清中SVCV病毒滴度为103.55 TCID50/mL,显著少于对照组;SVCV标志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表达水平也显著低于对照组,分别是对照组的0.022、0.015和0.022倍。这些研究结果表明LcATG10在大黄鱼抗病毒免疫应答中发挥作用,为深入研究自噬在大黄鱼抗病毒免疫中的分子机制奠定了基础。

沉默GmATG10导致大豆免疫反应的激活

自噬途径是真核生物中普遍存在的物质降解及循环利用的保守机制,在真核生物的生长发育以及免疫反应等方面起着至关重要的作用。而ATG10在自噬体(autophagosomes)的形成过程中起着非常重要的作用。为探讨大豆(Glycine max)ATG10在免疫防御反应中的功能,本研究采用大豆豆荚斑驳病毒(bean pod mottle virus,BPMV)诱导的基因沉默技术(virus-induced gene silencing,VIGS)成功地在大豆中同时沉默ATG10的两个同源基因(GmATG10a和GmATG10b);通过黑暗诱导的碳饥饿处理以及GmATG8积累水平的Western blotting分析证明,同时沉默GmATG10a/10b可导致大豆叶片出现自噬缺陷;抗病性鉴定与激酶分析证明沉默GmATG10a/10b可通过负调控Gm MPK3/6激活而参与免疫反应,是大豆免疫反应的负调控因子。

长链非编码RNA F-box富含亮氨酸的重复蛋白19反义RNA 1调节微小RNA-342-3p/自噬相关蛋白10轴对结直肠癌细胞增殖、迁移和奥沙利铂耐药性的影响实验研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA) F-box富含亮氨酸的重复蛋白19反义RNA 1(FBXL19-AS1)调节微小RNA(miR)-342-3p/自噬相关蛋白10(ATG10)轴对结直肠癌(CRC)细胞增殖、迁移和奥沙利铂耐药性的影响。方法:实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测组织及正常肠上皮细胞(NCM460)、人CRC细胞系RKO、HCT-8细胞及HCT-8/L-OHP细胞中FBXL19-AS1、miR-342-3p、ATG10 mRNA表达水平。将HCT-8细胞分为shFBXL19-AS1组、shRNA组、shFBXL19-AS1+inhibitor NC组和shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组,并以未转染的细胞为空白组。将HCT-8/L-OHP细胞分为L-OHP+shFBXL19-AS1组、L-OHP+shRNA组、L-OHP+shFBXL19-AS1+inhibitor NC组和L-OHP+shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组,并以未转染的细胞为空白组。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测HCT-8、HCT-8/L-OHP细胞增殖及其耐药性。划痕实验检测细胞迁移能力。免疫印迹法(Western blot)检测P-糖蛋白(P-gp)、增殖蛋白(Ki-67)、迁移侵袭增强子因子1(MIEN1)、ATG10蛋白表达水平。双荧光素酶报告基因实验分析miR-342-3p与FBXL19-AS1、ATG10靶向关系。结果:FBXL19-AS1、ATG10 mRNA表达在HCT-8/L-OHP细胞及CRC组织中增加,miR-342-3p表达则降低(均P<0.05)。shFBXL19-AS1组细胞增殖、细胞迁移、FBXL19-AS1和ATG10 mRNA表达以及Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较shRNA组和空白组降低,miR-342-3p表达则增加(均P<0.05)。shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组细胞增殖、细胞迁移、ATG10 mRNA以及Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较shFBXL19-AS1+inhibitor NC组增加,miR-342-3p表达则降低(均P<0.05)。L-OHP+shFBXL19-AS1组细胞增殖、细胞迁移、细胞耐药性及P-gp、Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较L-OHP+shRNA组和空白组降低(均P<0.05)。L-OHP+shFBXL19-AS1+miR-342-3p inhibitor组细胞增殖、细胞迁移、细胞耐药性及P-gp、Ki-67、MIEN1、ATG10蛋白表达较L-OHP+shFBXL19-AS1+inhibitor NC组增加(均P<0.05)。结论:干扰lncRNA FBXL19-AS1通过上调miR-342-3p/ATG10轴抑制CRC细胞的增殖、迁移,改善奥沙利铂耐药性。