大黄鱼ATG5基因的分子特征及促进病毒增殖的作用

为探究大黄鱼自噬相关基因5(LcATG5)在病毒感染中免疫应答中的作用,本实验从大黄鱼中克隆得到了自噬相关基因ATG5(LcATG5),其开放阅读框(ORF)全长828个核苷酸,编码275个氨基酸的蛋白质,预测的分子量为32.3 ku,等电点为5.7。氨基酸序列比对和系统进化分析结果显示,Lc ATG5与其他物种ATG5之间的序列一致性较高,含有1个高度保守的APG5结构域,并且与棘头梅童鱼ATG5的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,LcATG5在所检测的11个组织或器官中均有表达,在血液中表达量最高,在脾脏中表达量最低;LcATG5在来源于大黄鱼头肾组织的原代粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞以及细胞系LYCK细胞中也均有表达,在原代粒细胞中表达量相对较高,而在巨噬细胞中相对较低;病毒类似物poly(I:C)刺激后,这4种免疫细胞中LcATG5的表达水平都显著上调,其在LYCK细胞中变化最为显著,刺激后12 h上调了3.93倍。过表达Lc ATG5的鲤上皮瘤(epithelioma papulosum cyprini,EPC)细胞受鲤春病毒血症病毒(spring viremia of carp virus,SVCV)感染48 h后,细胞病变效应(cytopathic effects,CPE)明显高于对照组,细胞培养上清中SVCV的滴度为10^(13.82)TCID_(50)/mL,高于对照组10^(9.27)TCID_(50)/mL,同时细胞内SVCV标志基因SVCV-G、SVCV-M和SVCV-P的表达量分别上调了13.77倍、15.72倍和11.39倍,表明Lc ATG5过表达促进了EPC细胞中SVCV病毒增殖,上述结果为深入研究自噬和自噬相关基因在鱼类病毒感染过程中的作用及机制奠定了基础。

太平洋鳕ATG5基因的克隆及表达分析

ATG5(Autophagy related gene 5)基因是一种自噬相关基因,是形成自噬体的重要基因,ATG5基因的表达对自噬调控的成熟有重要作用。本研究中通过克隆,首次得到太平洋鳕Gadus macrocephalus ATG5c DNA部分序列,该序列长为895 bp,含有完整的开放阅读框(Open reading frame,ORF),编码275个氨基酸,其编码的蛋白质相对分子量约为32 200;经核苷酸序列比对发现,太平洋鳕ATG5核苷酸序列与半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis、尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus ATG5核苷酸序列的相似性均高达87.27%;利用太平洋鳕与其他物种ATG5核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,ATG5核苷酸序列系统进化树反映的亲缘关系基本符合传统分类学观点;氨基酸序列分析结果显示,ATG5蛋白氨基酸序列具有较高的保守性;利用绝对荧光定量PCR方法对ATG5基因在太平洋鳕各组织中的转录水平进行检测,结果显示,肝、脾和肾中的表达量高于其他组织,鳃、肾、脾、脑、肝和肌肉各组织中的ATG5 mRNA拷贝数分别为11.617 08、20.449 25、19.706 87、4.839 84、27.434 97、2.954 75 copies/ng。本研究结果将为进一步研究太平洋鳕细胞吞噬机制奠定基础,也为太平洋鳕的免疫机理和相关研究提供基础数据。

自噬基因Atg5和MAPLC3在急性白血病中的表达及其意义

目的探讨急性白血病(acute leukemia,AL)骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNC)中自噬基因Atg5和MAPLC3的表达及其临床意义。方法采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测150例AL患者和30例正常人BMMNC中Atg5和MAPLC3 mRNA的表达水平,对检测结果进行统计学分析。结果与对照组相比,急性髓系白血病(acute myelogenous leukemia,AML)各危险度组的Atg5和MAPLC3 mRNA表达水平均明显降低,且差异均有统计学意义(P均<0.01),从低危组、中危组至高危组,其Atg5和MAPLC3 mRNA表达水平逐步降低,组间两两比较,差异均有统计学意义(P均<0.01);与对照组相比,急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)各危险度组Atg5和MAPLC3 mRNA的表达水平均明显增高,差异均有统计学意义(P均<0.01),高危组患者的Atg5和MAPLC3mRNA表达水平明显低于标危组,差异均有统计学意义(P均<0.01);对照组和AL患者BMMNC中Atg5 mRNA水平与MAPLC3均呈显著正相关(P均<0.01)。结论自噬基因Atg5和MAPLC3 mRNA在AL中均有表达,且其表达水平呈正相关。AML患者的自噬活性明显降低,而ALL患者的自噬活性明显增高,随着危险度的增高,两种类型白血病自噬活性均星明显下降趋势。

日本三角涡虫细胞自噬基因Atg5的克隆和功能研究

细胞自噬相关基因Atg5在细胞自噬过程中发挥重要作用,其功能丧失损坏神经发生和轴突再生。涡虫是研究脑再生的良好模型,其头部切除后1周就能再生出1个新的脑结构。因此,研究Atg5基因在涡虫脑再生中的作用对探究自噬调控神经再生具有重要意义。本研究克隆了日本三角涡虫Atg5基因(DjAtg5)的全长cDNA序列,并利用RNAi技术研究了其在涡虫再生中作用。结果显示,DjAtg5 cDNA全长1014 bp,编码284个氨基酸。DjATG5含有ATG5蛋白质家族的Pfam结构域和高度保守的ATG5-ATG12相互结合位点。切割虫体后,DjAtg5表达显著增加。再生3~5天,其转录本主要在新再生的脑结构表达。但是,敲降DjAtg5并未引起涡虫脑再生异常,且对涡虫干细胞的增殖也未见明显影响。研究结果表明,DjAtg5参与涡虫脑结构的重新形成,但不是涡虫再生的重要调控因子。然而,自噬抑制剂3-MA能够阻止涡虫再生,说明细胞自噬机制对涡虫再生非常重要。

自噬相关基因LC3和ATG5在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和自噬相关基因-5(autophagy related gene-5,ATG5)在胃癌细胞发生发展不同阶段的表达情况并分析其临床意义。方法选取胃黏膜正常细胞、胃黏膜不典型增生细胞、胃癌细胞共58例,分别记为正常组(17例)、不典型组(19例)、胃癌组(22例),采用qRT-PCR、Western Blot、免疫组织化学法检测每组中自噬相关基因LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达水平,应用SPSS 23.0软件分析正常组、不典型组、胃癌组3组间LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达情况,并分析LC3和ATG5蛋白表达的相关性以及LC3和ATG5蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数的关系。结果正常组、不典型组、胃癌组中LC3和ATG5 mRNA及蛋白表达水平逐渐升高,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。LC3蛋白表达情况与性别、年龄、浸润深度、分化程度及淋巴结状态均不存在相关性。ATG5蛋白表达情况与浸润深度、分化程度及淋巴结状态均有相关性。LC3和ATG5蛋白在3组中均呈正相关(P<0.05)。结论细胞自噬可促进胃癌的发生发展,其机制可能与LC3、ATG5过度表达有关。LC3、ATG5在促进胃癌的发生发展中起相互协同的作用。

巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的构建并鉴定巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠,为研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发病机制中的作用提供动物模型。方法将引进LysM-Cre小鼠与Atg5^flox/+小鼠进行杂交、Atg5^flox/+小鼠自交,分别获得基因型为Atg5^flox/+Cre^+/-和Atg5^flox/flox Cre^-/-的子代小鼠;将上述两种基因型的子代小鼠杂交,得到巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠(Atg5^flox/flox Cre^+/-,Atg5^-/-)和对照小鼠(Atg5^flox/flox Cre^-/-,Atg5^+/+)。提取小鼠鼠尾组织基因组DNA,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后,在DNA水平判断小鼠基因型;提取小鼠骨髓来源巨噬细胞RNA和蛋白,利用基因测序和Western blot技术检验Atg5基因的敲除效果。结果成功建立巨噬细胞条件性Atg5基因敲除小鼠模型,该小鼠存活并且可育。在基因及蛋白水平上,巨噬细胞Atg5基因敲除成功;且与Atg5^+/+小鼠相比,Atg5^-/-小鼠自噬基础水平低下(p62明显增多,LC3Ⅱ明显减少),对于自噬激活剂雷帕霉素刺激不能恢复到正常基础水平。结论利用Cre/loxp系统,本研究成功构建并鉴定出条件性巨噬细胞Atg5基因敲除小鼠,为在动物水平研究巨噬细胞自噬在肾脏疾病发病机制中的作用提供研究平台。

自噬相关蛋白Atg5和Beclin-1在宫颈癌组织中的表达及与临床病理的相关性

目的探讨自噬相关蛋白Atg5和Beclin-1在宫颈癌组织中的表达及与临床病理的相关性。方法选取60例宫颈癌患者作为研究对象,将其分为恶性组,取同期60例良性子宫肌瘤或子宫腺肌瘤行全子宫切除手术的患者作为良性组,另取同期60例健康者的子宫颈组织标本进行分析,将其分为对照组。分析三组患者自噬相关基因5及Beclin1两种蛋白的表达情况、阳性率以及临床病理情况;应用回归分析,分析自噬相关基因5及Beclin1两种蛋白与宫颈癌病理的相关性。结果三组患者Atg5 mRNA及Beclin-1 mRNA表达情况对比差异显著,恶性组明显低于良性组和对照组(P<0.05);三组患者Atg5阳性与阴性患者例数对比差异显著,Beclin1阳性与阴性患者例数对比差异显著(P<0.05);60例宫颈癌患者中,Atg5阳性与Atg5阴性患者月经状态、年龄、肿瘤大小对比无明显差异(P>0.05),两组患者的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度对比差异显著(P<0.05),Beclin1阳性与Beclin1阴性患者月经状态、年龄、肿瘤大小对比无明显差异(P>0.05),两组患者的临床分期、淋巴结转移、组织分化程度对比差异显著(P<0.05);Spearman相关分析显示,月经状态、年龄、肿瘤大小与自噬相关基因Beclin1和Atg5不相关(P>0.05),临床分期、淋巴结转移和组织分化程度与自噬相关基因Beclin1和Atg5呈负相关(P<0.05)。结论自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1两种蛋白在宫颈癌患者的癌组织中表达低于良性肿瘤患者和健康人士,随着患者病情加重,自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1两种蛋白表达明显降低,自噬相关基因5(Atg5)及Beclin-1与宫颈癌患者的临床分期、淋巴结转移和组织分化程度呈负相关,因此可以应用自噬相关基因5(Atg5)及Beclin1来判断宫颈癌患者病情的严重程度。

新风胶囊治疗大鼠骨关节炎

目的主要观察新风胶囊(黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣)对骨关节炎大鼠外周血免疫球蛋白IgG1、IgG2α及细胞因子IL-4、TNF-α,软骨、胸腺、脾脏自噬基因(Atg5、Atg7、Atg12)的表达的影响。方法大鼠随机设正常对照组和模型对照组(均予生理盐水)、氨基葡萄糖对照组,以及新风胶囊组,每组10只。除正常对照组外,采用关节腔注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸方法制成骨关节炎大鼠模型,造模后第14天给药30 d。以光镜对大鼠软骨进行Mankin标准评分;采用ELISA法检测血清细胞因子IgG1、IgG2α、IL-4,和TNF-α;采用RT-PCR对骨关节炎大鼠软骨、胸腺、脾脏中的自噬相关基因Atg5、Atg7和Atg12进行检测。结果给药后,与正常组比较,模型组体质量明显下降,Mankin评分明显升高,血清IgG1、IgG2α、TNF-α升高,IL-4降低,在胸腺、脾脏、软骨等各组织中,Atg存在不同程度的降低(P<0.05或P<0.01);与氨基葡萄糖组比较,新风胶囊组体质量明显升高,Mankin评分明显降低,IL-4及Atg5、Atg7、Atg12升高(P<0.01或P<0.05)。结论新风胶囊可以抑制炎症反应,调节大鼠整体自噬水平,达到治疗骨关节炎。

免疫性血小板减少症(ITP)患儿外周血调节性T细胞数量减少伴随自噬的降低

目的检测自身抗体阳性的免疫性血小板减少症(ITP)患儿CD4^+CD25^+FOXP3^+调节性T细胞(Treg)数量以及自噬相关蛋白的表达。方法通过流式细胞术分选出初诊ITP患儿和健康对照儿童外周血中的Treg,根据抗体的平均荧光强度分别统计自噬相关基因5(ATG5)和ATG7蛋白水平,Western blot法检测CD4^+CD25^+Treg的蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化水平。结果与健康对照儿童相比,ITP患儿Treg数量显著降低,ATG5和ATG7表达降低,AKT和ERK的磷酸化水平均显著降低。结论在初诊自身抗体阳性的ITP患儿中,Treg数量降低,伴随增殖相关蛋白磷酸化水平及细胞自噬水平的降低。

农杆菌介导的外源基因在本氏烟中瞬时表达体系优化研究

为提高外源蛋白的表达量及稳定性,期望通过RNA、蛋白水平的研究,制定一套高效的外源蛋白表达体系。通过共表达沉默抑制子、添加定位信号、沉默自噬关键基因atg5,分析各处理对植物外源蛋白表达的影响。结果表明:共表达植物病毒沉默抑制子p25或HC-Pro抑制mRNA降解速率,提高外源蛋白表达水平;外源蛋白增加内质网定位信号,可提高蛋白的持续表达能力;瞬时沉默自噬途径关键基因atg5,有利于外源蛋白的积累。外源蛋白表达过程中对易降解的外源蛋白,通过添加定位信号并结合使用沉默抑制子、自噬途径缺陷植株,可作为提高外源蛋白表达量及稳定性的新策略。

自噬基因Atg3和Atg5在儿童急性白血病骨髓单个核细胞中的表达及临床意义

目的 通过检测儿童急性白血病（AL）骨髓单个核细胞（BMMNCs）中的自噬相关基因Atg3和Atg5的表达,探讨细胞自噬在儿童AL发病机制中的意义.方法 选取郑州大学第一附属医院儿科血液病区确诊AL患儿骨髓标本74例,分为初治组37例,缓解组28例,难治复发组9例;对照组选取非肿瘤性疾病患儿骨髓标本28例.淋巴细胞分离液分离出BMMNC,采用单丹磺酰尸胺（MDC）染色后荧光显微镜、流式细胞仪检测细胞自噬,反转录（RT）-PCR检测自噬基因Atg3 mRNA和Atg5 mRNA的表达.结果 荧光显微镜下观察到初治组、难治复发组细胞自噬现象较多见,经流式细胞术检测,初治组、难治复发组的自噬率分别为（17.07±2.31）％、（15.37±1.59）％,明显高于对照组的（2.71±1.57）％,差异均有统计学意义（t=28.29、20.96,P均＜0.01）;缓解组自噬率为（3.48±1.94）％,与对照组相比差异无统计学意义（t=1.634,P＞0.05）;难治复发组高于缓解组（t =16.61,P＜0.05）.Atg3 mRNA和Atg5 mRNA在初治组和难治复发组的表达均高于对照组,难治复发组亦均高于缓解组,差异均有统计学意义（F=67.592、106.160,P均＜0.008）;缓解组与对照组间比较差异无统计学意义（P ＞0.008）.结论 初治组和难治复发组BMMNC的自噬活性增强,自噬相关基因Atg3 mRNA、Atg5 mRNA的表达均上调,揭示Atg3、Atg5基因激活诱导的自噬活性增强可能与儿童AL的发生、发展和耐药机制有关.

芪玉三龙汤调节Beclin1,Atg5,LC3B表达以抑制肺癌肿瘤生长机制

目的:研究芪玉三龙汤对肺癌小鼠皮下移植瘤生长及对自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),自噬相关基因5(autophagy related genes,Atg5)及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3,LC3B)表达的影响。方法:采用Lewis肺癌细胞(lewis lung cancer cell,LLC)构建肺癌移植瘤小鼠模型,造模成功后随机分为模型组、芪玉三龙汤组、顺铂组及联合组,每组18只移植瘤小鼠。模型组每日按照生理盐水20 mL·kg^-1灌胃;芪玉三龙汤组每日按照80.48 g·kg^-1灌胃;顺铂组在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液(DDP)0.4 mL;联合组每日按80.48 g·kg^-1灌胃给药,并分别在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液0.4 mL;连续治疗21 d剥离瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率。苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织形态学改变。免疫组化检测肿瘤组织中Beclin1,LC3B蛋白表达和定位。蛋白免疫印迹法(Western blot)测定Beclin1,Atg5,微管相关蛋白1轻链3-I(LC3B-Ⅰ)及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)蛋白表达,并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤组织Beclin1,Atg5 mRNA转录水平。结果:芪玉三龙汤具有温和的移植瘤抑制作用,抑瘤率为31.2%;镜下观察芪玉三龙汤组肿瘤组织可见片状坏死的肿瘤细胞;免疫组化及Western blot实验表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够上调Beclin1,Atg5,LC3B蛋白的表达(P<0.01),并且能促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ;Real-time PCR结果表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够促进Beclin1,Atg5 mRNA的转录(P<0.01)。结论:芪玉三龙汤对肺肿瘤生长具有温和地抑制作用,其作用机制可能与上调自噬关键分子Beclin1,Atg5,LC3B表达,促进LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化有关。

水牛自噬相关基因克隆、序列分析及组织表达研究

为了克隆水牛ATG5、LC3基因序列,并分析自噬相关基因在水牛各组织中的表达情况,试验采用RT-PCR技术克隆了水牛自噬相关基因ATG5、LC3序列,并对其CDS序列进行了生物学信息分析,同时利用QRT-PCR方法,对ATG3、ATG5、ATG6、ATG7、ATG12、LC3、BECN1 7个基因在胎水牛心脏、肝脏和肌肉等9种组织、成年水牛卵巢中的mRNA表达水平进行了分析。结果表明:克隆得到水牛ATG5基因序列980 bp,其中包括CDS序列828 bp,预计编码275个氨基酸;水牛LC3基因mRNA序列全长499 bp,包括CDS序列378 bp,预计编码125个氨基酸;所分析的7个自噬相关基因在10种水牛组织中均有不同程度的表达。