利用重组PCR技术构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体

[目的]构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体。[方法]利用含有GFP基因和Nos终止子的A2GFP质粒和含有普遍适于真菌基因表达的构巢曲霉启动子(Ptrpc)的pUCATPH质粒,通过重组PCR技术构建Ptrpc-GFP-Nos重组基因,然后插入到农杆菌质粒pCAMBIA 1300的多克隆位点,构建适合真菌ATMT转化的GFP基因表达载体,并对其进行酶切和测序鉴定。[结果]通过重组PCR技术,仅通过Ptrpc启动子基因扩增、GFP-Nos基因扩增、Ptrpc-GFP-Nos重组基因扩增、1次双酶切、1次连接和转化,就成功地构建了适合真菌ATMT转化的GFP基因的表达载体pCAMBIA 1300-PGN,不需要构建中间载体,并大大简化了连接步骤。该载体经过PCR、酶切和测序鉴定,结构正确,连接准确,序列无误。[结论]该研究为真菌ATMT突变体的构建和快速检测奠定了基础。

改良ATMT转化技术在深绿木霉基因敲除中的应用

木霉菌是环境中具有重要经济价值的丝状真菌之一。高效率的基因敲除技术是深入研究木霉菌功能的必要手段。研究改进了传统的农杆菌介导的遗传转化技术（ATMT）,成功构建深绿木霉T23中碳代谢抑制因子cre1基因敲除突变株。首先查找深绿木霉全基因组序列,比对并扩增cre1基因侧翼序列,以改造后的p1300qh质粒为骨架构建cre1敲除载体p C1300qh：cre1-up∷hyg∷cre1-down,转化到农杆菌AGL-1。通过优化ATMT转化中木霉菌分生孢子浓度,改良培养方式和延长诱导转化时间等参数,获得最佳转化条件：木霉菌分生孢子浓度为8×10~6,筛选培养基改为IM培养基,诱导转化时间延长,成功筛选到可能的转化子10个。最后,经鉴定有1个转化子为cre1敲除转化子,9个为T-DNA随机插入。因此,为深绿木霉菌基因功能研究提供了可借鉴的高效便捷的遗传转化方法。

根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统的构建

[目的]建立根癌农杆菌介导的泡盛曲霉遗传转化系统,探讨利用泡盛曲霉表达异源蛋白的可行性。[方法]从国内主要菌种库中购买泡盛曲霉菌株,根据分泌蛋白图谱分析确定合适的宿主菌,在此基础上通过药物敏感性分析确定遗传转化的选择标记,并利用构建的泡盛曲霉遗传转化体系对米黑根毛霉脂肪酶基因RML进行转化、表达研究,通过转化子鉴定及性质分析考察泡盛曲霉作为异源蛋白表达系统的可行性。[结果]通过分泌蛋白图谱分析确定泡盛曲霉CBS115.52和CICC2257作为异源蛋白表达的宿主菌;药物敏感性试验确定潮霉素抗性基因(HygBr)作为有效的遗传选择标记;在此基础上,利用根癌农杆菌介导的转化方法(agrobacterium tumefaciensmediated transformation,ATMT),将带有HygBr的质粒pHGW-amdS成功导入泡盛曲霉宿主菌CBS115.52,建立以HygBr为选择标记的泡盛曲霉遗传转化体系。利用该体系,介导米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)的表达载体转化泡盛曲霉,通过底物水解试验、SDS-PAGE及Western blot确定RML基因已在泡盛曲霉中表达。[结论]该研究证明了根癌农杆菌介导转化泡盛曲霉作为异源蛋白的表达体系具有潜在的可行性。

稻曲病菌分生孢子高产突变体A2588的T-DNA插入位点侧翼基因分析

【目的】克隆稻曲病菌(Ustilaginoidea virens)分生孢子高产突变菌株A2588的T-DNA插入突变基因,解析该基因在稻曲病菌分生孢子形成中的功能,为进一步揭示稻曲病菌的分生孢子形成机制提供理论基础。【方法】测定A2588的产分生孢子能力、孢子萌发率、菌丝直线生长能力和热敏感性等生物学特性,利用hiTAIL-PCR、RACE和半定量PCR等方法克隆T-DNA插入突变基因,并结合生物信息学方法分析T-DNA插入导致分生孢子产量提高的分子机理。【结果】与稻曲病菌野生型菌株70-22相比,突变菌株A2588在PS培养液中产生数量为10倍以上的分生孢子,在MM培养液中产生数量约20倍的分生孢子,其在PS培养液中培养的菌球较为致密;在PSA和MM固体培养基上A2588产孢周期较短,孢子萌发率较低,虽然菌丝生长速度无明显差异,但热处理后菌丝不能恢复正常生长速率。hiTAIL-PCR和RACE法克隆了A2588中T-DNA侧翼基因,并利用RT-PCR检测侧翼基因表达水平,结果表明T-DNA侧翼基因spo76表达水平下降,进一步分析发现T-DNA可能插入至spo76的启动子区域,从而破坏了该基因启动子的部分功能。【结论】稻曲病菌突变菌株A2588中,T-DNA插入导致spo76启动子功能部分缺失,spo76表达水平下降,可能使A2588产孢周期缩短,并产生更多分生孢子。

稻曲病菌T-DNA插入突变体B2510的插入位点分析

以稻曲病菌T-DNA插入突变体库中致病力减弱突变菌株B2510为材料,通过分析T-DNA插入位点的侧翼序列和突变基因,分离出在稻曲病菌致病过程中起作用的基因。通过测定突变菌株B2510的生长速率、产孢能力及致病力发现,与野生型菌株P1相比,B2510田间接种表现为致病性减弱;在MM培养基上生长速率下降,而在PSA和TB3培养基中生长速率与野生型没有显著差异,但丧失产孢能力。Southern杂交显示T-DNA在突变菌株B2510中以双拷贝形式插入,利用TAIL-PCR技术扩增紧邻T-DNA两侧的侧翼序列,经过比对分析发现,T-DNA分别插在基因UV8b_1412的启动子区域和UV8b_1386的下游3′端,且稻曲菌基因组序列均未丢失,T-DNA上只有几个碱基发生变化。半定量RT-PCR分析基因的表达情况,显示两个基因在突变体B2510的表达量较P1均显著下降,推测T-DNA插入位点处的基因与稻曲病菌致病性相关,可能在某一阶段参与调控稻曲病菌在水稻上的致病过程。

层出镰刀菌T-DNA插入突变体库的构建与分析

苹果再植病害(Apple replant disease,ARD)是世界苹果主产区广泛发生的病害。前期研究表明,层出镰刀菌是造成苹果再植病害的重要致病菌之一,但其分子致病机制尚缺乏研究报道。本研究的目的是建立农杆菌介导的层出镰刀菌的遗传转化体系,并获得大规模的遗传稳定的层出镰刀菌ATMT突变体库,为研究该菌的分子致病机理奠定基础。对影响农杆菌介导转化效率的主要因子进行单因子条件测验,得到其最优转化体系为:抑制H10菌丝和孢子生长的潮霉素的浓度为100μg/mL,层出镰刀菌的分生孢子浓度为107个/mL,农杆菌OD600值为0.3,AS浓度为200μg/mL,共培养时间为48h,共培养温度为26℃。利用这一体系构建了3000个转化子的突变体库,并对随机选择的200个突变体进行潮霉素抗性基因的PCR检测,并经过在PDA培养基上5代培养,验证了T-DNA插入片段的稳定性。

Botryosphaeria dothidea突变体库的构建及分析

Botryosphaeria dothidea是重要的林果溃疡病害病原,分布广,危害重。本研究应用ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)介导的B.dothidea遗传转化体系成功构建了1053个转化子的突变体库,并且通过继代培养、PCR验证和Southern blot证明潮霉素B抗性基因整合到B.dothidea基因组中且可稳定遗传。以B.dothidea sdau11-126为对照,对526株转化子的菌落形态、生长速率和致病性进行分析,筛选获得了8个变异明显且稳定的突变体,以期为B.dothidea致病基因的分离、克隆和功能鉴定奠定基础。

尖孢镰刀菌ATMT体系的构建及其对甘草的促生效果评价

该研究旨在通过耐盐能力、产吲哚乙酸(IAA)能力、溶磷能力、产铁载体能力等指标评价一株甘草内生尖孢镰刀菌的体内功能,通过根癌农杆菌介导的遗传转化技术建立该菌的稳定遗传转化体系,并通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色的效率检测转化子的稳定性与染色高效性,筛选出高效稳定的转化子用于回染甘草,评价其对甘草幼苗生长的影响。研究结果表明该菌耐盐性较好,在含7%氯化钠的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上仍能生长,但生长速度随着PDA培养基中氯化钠含量的增高而减缓;该菌具有产吲哚乙酸的功能,其发酵液中IAA的质量浓度约为3.32mg·m L^(-1)。该研究成功构建了该菌的遗传转化体系,且其根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)体系高效而稳定。筛选获得1株兼具染色高效性和遗传稳定性的转化子,该转化子在甘草植株中的回染率为76.92%,能够显著提高一月龄甘草幼苗的主根长,促进甘草幼苗根部的生长发育。该研究结果可以为生物菌肥的开发及优质甘草的生长调控奠定基础。

红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响

为研究红曲霉过表达orf5基因对洛伐他汀含量的影响,丰富洛伐他汀代谢调控机制。用ATMT和REMI法将gus-orf5融合基因转化红曲霉,并对ATMT法的共培养条件和REMI法的内切酶进行优化筛选,对获得的潮霉素抗性菌株进行GUS染色和PCR鉴定,并检测阳性菌株的洛伐他汀含量变化。结果筛选出20μg/mL潮霉素的培养基作为转基因红曲霉的抗性筛选浓度,补充1/10 LB的Co-IM共培养基有利于ATMT法转化,在REMI法中Xba I介导的转化效果较好。用ATMT和REMI法均获得抗性菌落,经PCR检测表明orf5和hyg基因均已导入红曲霉,GUS染色呈蓝色。过表达菌株的洛伐他汀含量比对照明显提高,高达36.89%。红曲霉过表达orf5有利于增加洛伐他汀的积累,为深入研究红曲霉orf5基因的功能提供参考。

玉米弯孢叶斑病菌ATMT突变株构建及致病力分析

利用农杆菌介导的基因转化(Agrobacterium-mediated transformation,ATMT)技术,转化玉米弯孢叶斑病菌(Curvularia lunata),共获得转化子1 454个。对其中菌落形态、生长速率等性状有显著变化的8个突变株进行分析。通过离体叶片接种进行筛选,发现4个突变株致病性降低,2个突变株致病性增强。通过测定生长速率、产孢量及细胞壁降解酶活性发现,其中致病性减弱的突变株,其产孢量均有所下降甚至不产孢,突变株的PG酶活性普遍增强,但Cx酶活性没有明显变化,而2株强致病性突变株的Cx酶活性明显增强。

粉红粘帚菌的ATMT体系构建及定殖甘草条件优化

目的:建立并优化根癌农杆菌介导的甘草内生真菌粉红粘帚菌的遗传转化体系,优选粉红粘帚菌定殖甘草的条件,为生物菌肥的开发及优质甘草的育种奠定基础。方法:分别从乙酰丁香酮浓度、共培养时间和受体真菌分生孢子浓度3个方面对根癌农杆菌介导的遗传转化(ATMT)条件进行优化并优选转化子。采用正交试验,以共培养温度、共培养时间和孢子浓度为考察因素,定殖率为指标,优化粉红粘帚菌定殖甘草的条件。结果:粉红粘帚菌最适转化条件为共培养时间60 h、孢子浓度1×10^(7) cfu·mL^(-1)、乙酰丁香酮浓度150μmol·L^(-1),此条件下的转化效率为每1×10^(7)个受体真菌孢子可获得135个转化子。通过标记基因绿色荧光蛋白(GFP)的克隆和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)染色结果检测转化的准确性与稳定性。粉红粘帚菌通过浸种法定殖甘草的最佳条件为共培养温度25℃、共培养时间36 h、孢子浓度1×10^(6) cfu·mL^(-1),此条件下定殖率71.11%。结论:本研究成功建立了稳定高效的粉红粘帚菌ATMT体系及其定殖甘草的技术体系,可为甘草生物菌肥的开发奠定基础。