小鼠和大鼠NS5ATP4同源基因序列的生物信息学分析

目的:克隆、鉴定、分析小鼠和大鼠NS5ATP4基因序列, 确定编码产物序列,并对于其与人的NSSATP4基因及其编码产物的序列的同源性进行分析. 方法:利用基因芯片技术获得了人NS5ATP4的cDNA序列,利用生物信息学技术确定小鼠、大鼠的NS5ATP4的基因及其编码产物的序列,并对于其同源性进行生物信息学分析. 结果:利用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及其编码产物的序列,小鼠和大鼠的NS5ATP4编码基因区分别由762和756个核苷酸(nt)组成.编码产物分别由263和261个氨基酸残基(aa)组成.与人NS5ATP4基因和蛋白质一级结构序列的同源性分别为90.29%,84.25%和95.65%,86.96%. 结论:应用生物信息学技术确定了小鼠和大鼠的NS5ATP4 的基因及编码产物的序列.

新基因NS5ATP4表达产物下调细胞周期素B2基因表达的研究

目的探讨新基因NS5ATP4表达产物对细胞周期素B2(cyclinB2)基因启动子转录的调节作用。方法根据文献确定细胞周期素B2的启动子区域,聚合酶链反应(PCR)扩增细胞周期素基因因启动子(B2p),克隆至真核报告基因表达载体pCAT3Basic中,构建pCAT3cyclinB2p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性并与pcDNA3.1()NS5ATP4共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果成功获得细胞周期素B2启动子的正确克隆。pCAT3cyclinB2p和pcDNA3.1()NS5ATP4共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3Basic空载体的10倍,pCAT3cyclinB2p的0.14倍。结论本文克隆的细胞周期素B2启动子有顺式调节下游基因表达的活性,NS5ATP4对细胞周期素B2基因的转录具有下调作用。

三元混配M(ATP)(3,4Lu)^(2-)配合物的稳定性研究

25℃下,用pH电位滴定法研究了二元M(3,4Lu)2+和三元混配M(ATP)(3,4Lu)2-配合物(ATP4-=三磷酸腺苷,3,4Lu=3,4二甲基吡啶,M2+=Co2+,Ni2+,Cu2+或Zn2+)在水溶液中的稳定性,三元混配配合物相对于二元配合物的稳定性用M(3,4Lu)2++M(ATP)2-=M(ATP)(3,4Lu)2-+M2+的平衡常数ΔlogKM(=logKM(ATP)M(ATP)(3,4Lu)-logKMM(3,4Lu))表示,结果比统计值大,这可能主要归因于三元混配配合物分子内ATP4-与3,4Lu之间的σ-π协同效应及其芳环间的堆积作用,′HNMR谱研究确证了这种堆积作用的存在。

遗传性远端肾小管性酸中毒合并耳聋相关基因Atp6v0a4在小鼠内耳发育过程中的表达

目的常染色体隐性遗传远端肾小管酸中毒是一种严重的酸碱平衡紊乱性疾病,常常合并有感音神经性聋,ATP6V0A4被证实是其致病的相关基因,目前仍不明确致病机制。我们拟通过研究Atp6v0a4在不同发育阶段小鼠的内耳表达来探究ATP6V0A4在听觉系统形成中的作用。方法选择不同发育时期健康的昆明小鼠(E18,P1,P7,P14,P21),应用免疫荧光标记技术结合激光共聚焦显微镜观察Atp6v0a4蛋白在内耳的定位与表达。West-ern-blot定性定量研究该蛋白在不同时期小鼠内耳蛋白表达变化。结果 Atp6v0a4蛋白主要表达部位为耳蜗内毛细胞、外毛细胞、血管纹、内淋巴囊以及螺旋神经节,且在不同发育阶段表达位置稳定。Western-blot结果提示Atp6v0a4在小鼠内耳广泛表达,在不同发育阶段,Atp6v0a4在Corti’s器及螺旋神经节及血管纹中表达相对稳定,而在前庭组织中表达下降。结论通过对不同发育阶段的小鼠耳蜗切片进行Atp6v0a4蛋白表达分析研究,明确了Atp6v0a4在小鼠内耳的表达,为深入研究Atp6v0a4在内耳发育过程中的作用和致聋机制奠定了基础。

猪ATP6V0A4基因启动子核心区的筛选与分析

ATP6V0A4基因编码V-ATP酶的一个亚基,与H+转运相关,是遗传性远端肾小管性酸中毒的致病基因。在前期研究中发现,民猪在遭受冷应激后其背脂中ATP6V0A4基因的转录水平发生了显著上升(P<0.05)。为了分析ATP6V0A4基因在转录水平的调控机制,构建了一系列长度不同的含有该基因5′端启动子区域的双荧光素酶报告基因质粒,转染PK15细胞并检测双荧光素酶的相对活性。根据检测结果,利用重叠PCR技术定点靶序列,预判可能存在的转录调控因子。结果发现,该基因启动子区的-1504~-1 bp片段具有转录活性,通过2轮启动子截短试验后判定-265~-1 bp区域内存在正调控元件,-581~-265 bp区域内存在负调控元件。定向缺失-205~-190 bp,-120~-110 bp小片段后,确定-205~-190 bp区域内存在调控该基因转录的正调控元件结合位点,通过在线软件预测后发现E2F3、SP2、EGR1、E2F6、CTCFL、E2F1、SP1和ETF可能是该基因的正调控转录因子。首次克隆了猪的ATP6V0A4基因的启动子区域并进行了转录因子结合位点的筛选与鉴定,为后续研究其在冷应激状态下的转录调控奠定了基础。

转基因重组质粒ATP4B-SV40T-IRES-GFP的构建及鉴定

目的:构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒并进行鉴定.方法:根据小鼠ATP4B启动子序列设计引物,获得的小鼠ATP4B基因启动子序列,并加入限制性内切酶酶切位点.将其装入载体IRES-GFP,获得重组载体ATP4B-IRES-GFP并进行酶切鉴定.之后将SV40T基因克隆入ATP4B-IRES-GFP载体,并用限制性内切酶PstI和AseⅠ进行验证.结果:将小鼠ATP4B启动子序列插入IRES-GFP载体,经过酶切验证获得正确的ATP4B-IRES-GFP质粒;将SV40T片段插入ATP4B-IRES-GFP,质粒测序及酶切结果验证获得正确的ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒.显微注射入小鼠受精卵可获得阳性小鼠.结论:成功构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒,可用于下一步构建原发性胃癌转基因小鼠.

Cu^(2+)-ATP^（4-）多吡啶配合物的稳定性研究

用ｐＨ电位滴定法测定二元配合物Ｃｕ（ＡＴＰ）２（ＡＴＰ为三磷酸腺苷）和三元配合物ＣｕＬ（ＮＴＰ）２［ＮＴＰ＝ＡＴＰ或ＵＴＰ（三磷酸尿苷），Ｌ＝ｐｈｅｎ（邻菲咯啉），ＩＰ（咪唑并［４，５ｆ］邻菲咯啉）或ＰＩＰ（２－苯基咪唑并［４，５－ｆ］邻菲咯啉）］的稳定常数，研究ＣｕＬ（ＡＴＰ）２中多吡啶芳环Ｌ与腺嘌呤之间的堆积作用－结果表明，堆积作用的大小顺序为ＰＩＰ＞ＩＰ＞ｐｈｅｎ，这与多吡啶芳环的结构有关－

基于光磁结构的表面增强拉曼光谱技术痕量检测4-ATP分子

表面增强拉曼散射(SERS)作为一种高灵敏的分子检测技术在分析检测领域具有重要的应用前景。在本研究中,以Au纳米粒子作为等离子体共振基,超顺磁Fe3O4纳米粒子作为磁性基,基于种子生长的液相合成方法,获得了Au负载的Fe3O4@SiO2光磁SERS基底材料。Raman光谱测试表明:该基底材料具有较好的磁响应性,可用于对胺基苯酚(4-ATP)分子的快速富集与高灵敏检测(检测限低至10^-6 M以下)。

食蟹猴疟原虫 (Plasmodium cynomolgi)中一个真核翻译起始因子4A(eIF-4A)同源蛋白的cDNA克隆、表达和ATP酶活性测定(英文)

真核翻译起始因子 4A(eukaryoticinitiationfactor 4A ,eIF 4A)是DEAD盒蛋白家族的ATP依赖性的RNA解旋酶类中的一个原型成员 .它在真核细胞的蛋白质合成的起始过程中起着关键性作用 .通过PCR扩增和放射探针杂交相结合的方法筛选食蟹猴疟原虫 (Plasmodiumcynomolgi)的cDNA文库 ,克隆了一个eIF 4A同源蛋白的完整cDNA序列 ,命名为CH1F .CH1F全长 1 75 3bp ,包含一个1 1 97bp的完整阅读框 ,推测编码一个由 398个氨基酸组成的蛋白 .对CH1F的蛋白序列用BlastP进行搜索和分析 ,提示它应该是DEAD盒家族的一个eIF 4A同源蛋白 ;用DNAStar将其与许多典型的DEAD盒蛋白序列进行比对分析 ,结果显示 :比起其它的DEAD盒蛋白 ,它与eIF 4A或eIF 4A的同源蛋白具有更高的同源性和更多序列上的相似结构域 .将包含完整阅读框的片段亚克隆进表达载体pET 2 8a (+) ,在大肠杆菌DH5α中表达 ,产生的融合蛋白大小在 4 5kD左右 .对该融合蛋白进行纯化、重新折叠和初步鉴定 .ATP酶活性检测显示 ,该融合蛋白只有很低的ATP酶活性 ,而且它的ATP酶活性似乎不依赖于核酸底物 .对这一检测结果给出 3种可能的原因 .这一检测结果与根据序列分析得到的推论———CH1F蛋白可能是一个eIF

ATP4B在不同程度胃黏膜病变中的表达及其与幽门螺杆菌感染的关系

目的研究ATP4B在胃黏膜病变演化过程中的表达变化,并探讨其与幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)感染的关系。方法根据组织形态学检查将221例胃镜活检标本分为慢性浅表性胃炎(CSG)、慢性萎缩性胃炎(CAG)、肠上皮化生(IM)和异型增生(Dys)4组;采用免疫组织化学方法检测ATP4B的表达情况;根据胃镜检查时快速尿素酶试验结果确定Hp感染状态。结果 ATP4B表达水平随胃黏膜病变演化而降低,在4组的表达率分别为51.4%、15.4%、15.9%及5.0%,CSG组ATP4B表达水平显著高于其他各组(P<0.05)。CSG组中Hp阳性标本ATP4B的表达率为33.3%,显著低于其在Hp阴性标本中的表达率(59.7%,P<0.05);在另外3组中,Hp阳性标本与阴性标本ATP4B的表达率差异无统计学意义(P>0.05)。结论在胃黏膜病变演化过程中,ATP4B的表达随胃黏膜病变的进展而降低;Hp在胃黏膜病变演化的早期阶段抑制了ATP4B的表达。

质膜钙ATP酶异构体1～4的剪接体在新生大鼠前庭器官的表达

目的研究质膜钙ATP酶异构体(plasma membrane Ca^(2+)-ATPase isoforms,PMCAs)1~4(PMCA1~4)的A端和C端剪接变异体在新生大鼠前庭器官的表达。方法取出生2天的健康SD大鼠10只,断头后分离出前庭器官(椭圆囊斑和球囊斑),提取总RNA,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,检测PMCA1~4的A端和C端剪接变异体的表达。结果在新生大鼠的椭圆囊斑和球囊斑PMCA1~4表达的剪接体分别为PMCA1x/b,PMCA2w/(a、b),PMCA3z/(a、b、c)和PMCA4(x、z)/b。结论在新生大鼠前庭器官,PMCA1、PMCA2、PMCA3和PMCA4之间表达的A端和C端剪接变异体类型均不同,这可能是由于椭圆囊斑和球囊斑对这些PMCA亚型有着不同的Ca2+调节需求。

粟酒裂殖酵母蛋白Atp4定位和功能的研究

研究粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中Atp4的定位和参与线粒体功能的机制。借助于基因敲除、荧光显微镜观察、线粒体提取、生化试剂处理和Western blotting等技术开展研究。在甘油培养基上,Δatp4突变菌株表现出生长缺陷,是线粒体呼吸缺陷菌;Fluorescence microscope观察到用GFP标记的Atp4和线粒体是共定位的;采用生化试剂TritonX-100和蛋白酶K处理以及碳酸钠处理Atp4-Flag和yHL6381线粒体,结果表明Atp4定位在线粒体内膜;Western blotting实验结果表明Atp4缺失导致Cob1、Cox1、Cox2和Atp6表达量剧烈下降,Cox3和Cox4蛋白表达量也有略微下降。综上所述,Atp4在线粒体内膜发挥功能,对于维持线粒体编码蛋白的正常表达至关重要,是线粒体呼吸链功能的发挥所必需的。

ATP6V0A4基因变异致新生儿远端肾小管酸中毒1例报告及5年随访结果

目的分析新生儿远端肾小管酸中毒(DRTA)的基因型、临床特点及远期发育情况。方法回顾分析1例DRTA患儿的临床资料。结果足月顺产女婴,生后体质量不增、睡眠差、哭闹、轻度脱水等。多次血气分析提示严重的高氯性酸中毒、低钾血症,碱性尿液,肾脏钙质沉着。高通量基因测序显示患儿ATP6V0A4基因有复合杂合变异,分别是来自父亲的C.2351dupT移码变异(编码区第2351号插入胸腺嘧啶,导致氨基酸改变p.F785Ifs^(*)28)和来自母亲的C.1504dupT移码变异(编码区第1504号插入胸腺嘧啶,导致氨基酸改变p.Y 502 Lfs^(*)22),此变异为致病性变异,符合常染色体隐性DRTA诊断。患儿经枸橼酸合剂治疗5年,生长发育追赶至正常,无明显并发症。结论新生儿期DRTA,要高度警惕遗传性致病因素,必要时行基因测序以明确诊断,尽早干预。

ATP敏感性钾通道的开放通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗高糖引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症

目的:探讨开放ATP敏感性钾通道(K_(ATP)通道)能否抑制Toll样受体4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路对抗高糖(HG)引起的H9c2心肌细胞损伤和炎症。方法:应用Western blot测定TLR4和NF-κB p65的蛋白水平;应用ELISA法检测细胞培养液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平;采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)测定心肌细胞存活率;罗丹明123染色荧光显微镜照相法测定线粒体膜电位(MMP);双氯荧光素染色荧光显微镜照相法测定细胞内活性氧簇(ROS)水平;Hoechst 33258核染色荧光显微镜照相法检测凋亡细胞数量。结果:H9c2心肌细胞经HG(35 mmol/L葡萄糖)处理24 h,胞内TLR4和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)的蛋白水平明显增加,100μmol/L K_(ATP)通道开放剂二氮嗪(DZ)预处理30 min可抑制HG对TLR4和p-NF-κB p65蛋白水平的上调作用;此外,30μmol/L TAK-242(TLR4抑制剂)和HG共处理心肌细胞24 h也可减轻HG对p-NF-κB p65的上调作用。另一方面,100μmol/L DZ预处理有明确的心肌保护作用,可抑制HG引起的细胞毒性、炎症反应、线粒体损伤、氧化应激和细胞凋亡,使细胞存活率升高,并减少IL-1β和TNF-α分泌水平、MMP丢失、ROS生成及凋亡细胞数量;而30μmol/L TAK-242或100μmol/L PDTC(NF-κB抑制剂)共处理心肌细胞24 h也可发挥和DZ相类似的作用,能抑制HG引起的上述损伤和炎症反应。结论:开放K_(ATP)通道可通过抑制TLR4/NF-κB通路对抗HG引起的H9c2肌细胞损伤和炎症。

Transient receptor potential vanilloid 4-dependent calcium influx and ATP release in mouse and rat gastric epithelia

AIM: To explore the expression of transient receptor potential vanilloid 4(TRPV4) and its physiological meaning in mouse and rat gastric epithelia. METHODS: RT-PCR and immunochemistry were used to detect TRPV4 m RNA and protein expression in mouse stomach and a rat normal gastric epithelial cell line(RGE1-01), while Ca2+-imaging and electrophysiology were used to evaluate TRPV4 channel activity. ATP release was measured by a luciferin-luciferase assay. Gastric emptying was also compared between WT and TRPV4 knockout mice. RESULTS: TRPV4 m RNA and protein were detected in mouse tissues and RGE1-01 cells. A TRPV4-specific agonist(GSK1016790A) increased intracellular Ca2+ concentrations and/or evoked TRPV4-like current activities in WT mouse gastric epithelial cells andRGE1-01 cells, but not TRPV4 KO cells. GSK1016790 A or mechanical stimuli induced ATP release from RGE1-01 cells while TRPV4 knockout mice displayed delayed gastric emptying in vivo. CONCLUSION: TRPV4 is expressed in mouse and rat gastric epithelium and contributes to ATP release and gastric emptying.

真菌中的脂质不对称调节和P4型ATP酶

脂质组分在双分子膜中不对称分布是广泛存在于真核细胞中的现象,有助于膜系统的出芽和融合,从而促进胞吞胞吐、蛋白分选运输等生理过程。多种蛋白参与维持脂质不对称,其中P4型ATP酶是重要的脂质转运体。P4型ATP酶又称脂质翻转酶,主要介导氨基磷脂的转位。在酿酒酵母、新生隐球菌、白念珠菌和构巢曲霉中,多种P4型ATP酶亚基的缺失导致蛋白运输失常,对唑类药物的敏感性升高,细胞壁完整性受损,毒力减低,在巨噬细胞中生存能力减弱等表型,提示脂质翻转酶的重要性及其作为抗真菌靶点的潜力。

外周血CD4^(+)PD-1^(+)Tcells及CD4^(+)T淋巴细胞ATP含量与复发性卵巢癌疗效的相关性分析

目的 探讨外周血CD4^(+)程序性细胞死亡受体-1(PD-1)^(+)T cells及CD4^(+)T淋巴细胞三磷酸腺苷(ATP)含量与复发性卵巢癌疗效的相关性。方法 选取30例复发性卵巢癌患者为复发组,30例未复发卵巢癌患者为非复发组;另选取30名同期体检健康者作为对照组。评估外周血CD4^(+)PD-1^(+)T cells及CD4^(+)T淋巴细胞ATP含量与复发性卵巢癌疗效的相关性。结果 复发组和非复发组的CD4^(+)PD-1^(+)T cells较对照组明显升高(P<0.05)。复发组和非复发组的CD4^(+)T淋巴细胞ATP含量较对照组明显降低(P<0.05)。复发组治疗后CD4^(+)PD-1^(+)Tcells显著低于治疗前(P<0.05),治疗后CD4^(+)T淋巴细胞ATP含量显著高于治疗前(P<0.05)。CD4^(+)PD-1^(+)T cells与复发性卵巢癌疗效成负相关(r=-0.393,P=0.039),CD4^(+)T淋巴细胞ATP含量与复发性卵巢癌疗效成正相关(r=0.449,P=0.031)。结论 复发性卵巢癌患者外周血CD4^(+)PD-1^(+)T cells及CD4^(+)T淋巴细胞ATP含量与疗效密切相关。

PMCA1-4及其A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织中的表达

目的研究质膜钙ATP酶异构体1-4(plasma membrane Ca^(2+)-ATPase 1-4,PMCA1-4)在成年大鼠前庭组织的分布部位,及其A端和C端剪接变异体的表达类型。方法选择8周龄健康SD大鼠,解剖出内耳器官行前庭切片,同时取前庭椭圆囊斑和球囊斑提取总RNA。通过免疫荧光方法检测PMCA1-4在成年大鼠内耳前庭组织的表达部位,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PMCA1-4的A端和C端剪接变异体在成年大鼠前庭组织的表达类型。结果球囊和椭圆囊荧光染色切片中,于毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA1表达,毛细胞纤毛中可见PMCA2强表达,毛细胞和支持细胞的胞体外侧膜可见PMCA3弱表达,PMCA4几乎不表达。4种PMCA亚型在球囊表达的剪接体分别为PMCA1x/b、PMCA2w/b、PMCA3z/(a,b)和PMCA4x/b,它们在椭圆囊的表达类型与球囊相同。结论PMCA1-4在成年大鼠前庭器官的表达部位存在差异,这4种PMCA亚型的剪接体类型也各不相同。这种差异性可能是为了满足前庭组织和亚细胞结构域对Ca2+调节的特殊需求。

不同高温胁迫方式对紫花苜蓿P_(4)型ATP酶基因ALA_(2)和ALA_(6)的影响

为探明紫花苜蓿P_(4)型ATP酶基因与高温胁迫的关系,以‘德钦’紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.‘Deqin’)为材料,分析在瞬时高温(Ta)、阶梯高温(Tb)、低温+阶梯高温(Tc)、低温+高温(Td)4种不同方式胁迫处理后,紫花苜蓿根和叶中相对电导率、ALA_(2)和ALA_(6)基因的相对表达量的变化。结果表明,根和叶在不同高温胁迫方式后,除了根在Tc处理后和叶在Td处理后相对电导率与对照差异不显著外,其他胁迫方式相对电导率均显著升高(P<0.05),说明高温会破坏紫花苜蓿根和叶中细胞膜的相对完整性。不同高温胁迫方式处理对紫花苜蓿根和叶中ALA_(2)和ALA_(6)基因的相对表达量均有显著性影响(P<0.05),Tc处理后根中ALA_(2)和ALA_(6)的相对表达量最高,分别约为对照的4.32和2.48倍;Td处理后叶中ALA_(2)的相对表达量最高,约为对照的6.91倍;且在同高温方式下根和叶中ALA_(2)相对表达量高于ALA_(6)。在高温胁迫下ALA_(2)和ALA_(6)共同高表达可以减轻根和叶中细胞膜的受损程度。

日产柴ATP4——未来大型货车的希望

在世界各地的汽车展上,许多概念小客车纷纷亮相,但是很少有概念货车登场,一个原因是在汽车展上展示未来货车的形象,对使用者(货运公司)来说是没有多少趣味的。他们更多地重视盈利和亏损的计算。由于新的排放法规的颁布,目前正迫使日本的货车制造公司投入更多的资金用于开发新的货车。去年秋季的东京汽车展上。