生物合成谷胱甘肽种间耦合ATP再生系统的构建

利用重组大肠杆菌Ⅱ 1中的谷胱甘肽合成酶系和面包酵母WSH J7中的ATP生物合成酶系 ,构建了一个以葡萄糖为能源的种间耦合ATP再生系统。经过通透性处理的酵母细胞几乎不能消耗葡萄糖。在反应体系中添加 1mmol/LAMP和 0 0 5mmol/LNADH ,即可启动酵母的酵解途径。提高耦合系统中的葡萄糖浓度 ,可促进GSH的合成。当葡萄糖浓度为 40 0mmol/L时 ,系统内GSH浓度达到 1 0 4mmol/L(3 2 g/L)。Mg2 +缺乏时 ,耦合系统和外加ATP的非耦合系统均不能合成谷胱甘肽。耦合系统中Mg2 +与ATP形成螯合物 ,可能是导致耦合系统中GSH产量较低的原因。在耦合系统中补加Mg2 +,反应 6h时GSH浓度达到 1 4 3mmol/L(4 4g/L)。

大肠杆菌—面包酵母种间耦合ATP再生系统中生物合成谷胱甘肽

利用混合悬浮培养的方法，构建了一个由重组大肠杆菌的谷胱甘肽生物合成酶系与面包酵母的糖酵解途径组成的ＡＴＰ再生系统，验证了该系统用于谷胱甘肽（ＧＳＨ）生物合成的可行性．研究了葡萄糖浓度、细胞量对耦合系统合成ＧＳＨ 能力的影响，讨论了所构建的ＡＴＰ再生系统中ＧＳＨ 合成能力较低的可能原因．

ATP再生系统及其应用

构建ＡＴＰ再生系统是提高生物合成酶反应经济性的一个有效措施。本文讨论了ＡＴＰ再生系统的两种形式自耦合反应系统与种间耦合反应系统在生产ＧＭＰ、ＡＴＰ、ＩＭＰ、ＧＳＨ和ＣＤＰ胆碱中的应用，提出了构建ＡＴＰ再生系统的必要条件并分析了该系统目前存在的问题，以期为国内同行开展类似研究提供参考。

大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶的表达·纯化及鉴定

[目的]获得大肠杆菌的Ⅱ型丙酮酸激酶。[方法]首先用MEGA7软件对不同生物丙酮酸激酶的编码基因进行聚类分析;通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了大肠杆菌的Ⅱ型丙酮酸激酶基因pykA,将其克隆到pET_28a载体中,构建了重组质粒载体pET_28a-pyk A并在大肠杆菌BL21中实现了Ⅱ型丙酮酸激酶(PykA)的高效表达;利用镍柱亲和层析系统纯化了PykA蛋白,并进行了高效液相色谱(HPLC)检测。[结果]聚类分析结果表明,大肠杆菌Ⅱ型丙酮酸激酶与其他原核生物的丙酮酸激酶氨基酸序列具有高度同源性。HPLC检测发现Ⅱ型丙酮酸激酶Pyk A在体外可以高效地将ADP转化为ATP。[结论]该研究获得了Ⅱ型丙酮酸激酶,为ATP的合成以及Ⅱ型丙酮酸激酶为基础的ATP再生系统的研究提供了参考。