茶树硒营养代谢关键酶ATP硫化酶基因克隆及启动子结构分析

为探明茶树硒营养代谢关键酶基因ATP硫化酶的表达调控规律,通过PCR获得APS的DNA全长序列,应用genome walking克隆了APS基因的5′侧翼序列,采用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子的特定结构,如TATA-box,CAAT-box等,为深入研究茶树硒营养代谢关键酶的表达调控机制奠定了理论基础。

油菜叶片衰老相关基因的分离──ATP硫化酶cDNA的克隆和序列分析

通过筛选缩减ｃＤＮＡ文库中在油菜叶片衰老阶段表达而在绿叶中不表达的ｃＤＮＡ克隆，分离了与油菜叶片衰老有关的基因ＬＳＣ６６。ＤＮＡ序列测定和分析结果表明，ＬＳＣ６６的全长可读框架由１３８０个碱基组成，编码４６０个氨基酸，它的核昔酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶基因有８６．６７％的同源性，其推导的氨基酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶的氨基酸序列有９１．７４％的同源性。对ＬＳＣ６６基因产物在植物叶片衰老过程中的作用进行了讨论。

茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建

采用能有效转化双子叶植物的表达载体pBI121构建植物硒营养代谢关键酶基因的表达载体,将原载体中GUS基因用茶树ATP硫化酶基因(APS1和APS2)替换,将硒半胱氨酸甲基转移酶基因(CsSMT)连接到pBI121载体上直接与GUS基因相连,分别构建了目的基因植物表达载体pBI-APS1、pBI-APS2和pBI-CsSMT。通过三亲杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转化工程菌,为通过植物基因工程获得富硒农产品打下基础。

甜菜中两种ATP硫化酶亚型在盐胁迫下的表达(Ⅰ)

根据生物信息学分析,得到甜菜中存在两种ATP硫化酶亚型,但对盐胁迫积极响应的基因位于叶绿体染色体上。经过系统进化树的构建,发现该基因核酸序列与同为苋科的菠菜和藜麦具有极高的同源性。对蛋白序列进行分析得到该蛋白为亲水性蛋白质,亚细胞定位于细胞质。生育酚环化酶的生物信息学分析显示,该基因位于甜菜第二条染色体上,核酸序列与菠菜和葡萄具有极高的同源性。对蛋白序列的分析显示,该蛋白为亲水性蛋白,亚细胞定位于叶绿体。同时预测了这两种蛋白的二级结构与三级结构。

多酶催化合成3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸反应体系的构建及优化

3’-磷酸腺苷-5’-磷酰硫酸(PAPS)是目前发现的唯一的"活性"硫酸基团供体,在生物肝素酶法硫磺化反应中起到重要作用,但化学合成的成本高。如何大量低成本制备PAPS是实现酶法合成肝素工业化的关键因素。本文克隆表达了酶法合成PAPS的两个酶:三磷酸腺苷(ATP)硫化酶和5’-腺苷磷酰硫酸(APS)激酶。构建了一条体外合成PAPS的途径。首先利用ATP硫化酶将ATP转化生成APS,同时产生副产物无机焦磷酸(PPi),APS再在APS激酶作用下转化生成PAPS。研究了Mg2+浓度、缓冲体系和p H、温度以及无机焦磷酸水解酶(PPase)的添加对该酶反应的影响。通过添加无机焦磷酸水解酶(PPase),极大提高了PAPS的转化率。在最优条件下考察不同ATP浓度下PAPS随时间的积累量变化,发现反应过程中存在底物抑制作用;ATP浓度为50 mmol?L?1时,反应25 h,PAPS的积累量为18.87 mmol?L?1。反应过程中分批补料ATP,能极大提高催化效率。反应11.5 h,PAPS积累量可达20.36 mmol?L?1(10.32 g·L?1),转化率为81.4%。