百合ATP合成酶家族基因ATPase3的克隆和生物信息学分析

【目的】为有效解决百合花粉污染问题,利用分子生物学技术培育雄性不育的无花粉百合,从基因克隆和生物信息学角度研究百合ATP合成酶家族基因ATPase3在导致百合雄性不育过程中的作用,为应用该基因进行百合无花粉分子育种提供一定的理论基础。【方法】以百合可育系与不育系花粉母细胞时期花药为试验材料,在百合可育系与不育系转录组测序结果中筛选出1个花粉母细胞时期显著上调表达的ATPase3基因,利用荧光定量qRT-PCR技术检测ATPase3基因在百合可育系与不育系花粉母细胞时期不同部位的相对表达量。结合qRT-PCR与Race技术扩增得到百合花药ATPase3基因cDNA全长序列,并通过Prot Param、Prot Scale、NCBI Conserved Domain、SWISS-MODEL等在线生物信息学数据库对百合ATPase3同源性、蛋白结构、理化性质等进行生物信息学分析。【结果】百合ATPase3基因在花器官中表达量最高,其中在可育系花药中的表达量是不育系的7倍。通过克隆得到百合ATPase3基因,该基因全长327 bp,编码109个氨基酸,含有1个典型的保守ATPase3结构域;编码蛋白相对分子量约为12.14 KD,理论等电点为7.71,为疏水性蛋白,存在跨膜结构,并预测蛋白二级和三级结构。生物信息学分析说明该预测蛋白具有典型ATP合成酶特征。同源序列分析表明,该蛋白与拟南芥质膜ATPase3同源性最为接近,与拟南芥H[+]ATPase1,H[+]ATPase2,H[+]ATPase3,H[+]ATPase8同源性也较为接近。推测该蛋白属于百合中提供能量的质膜离子转运蛋白,它在百合不育系花药中表达量下调,提供能量不足,导致雄性不育。【结论】本研究验证了ATPase3基因与百合雄性不育相关,并成功克隆得到了ATPase3基因,对该基因进行了生物信息学分析和功能预测,为百合ATPase3基因编码的质膜离子转运蛋白功能缺失导致百合雄性不育现象的发生提供一定的理论基础。

应用mRNA差异显示法检测肝脂素诱导的KG-1细胞凋亡相关基因表达的改变

目的观察肝脂素（heplipin）对KG-1细胞的凋亡诱导作用。比较肝脂素诱导KG-1细胞凋亡前后的基因表达谱，寻找与白血病细胞凋亡相关的基因。方法应用DNA倍体分析和DNA凝胶电泳的方法，证实肝脂素可诱导KG-1细胞凋亡。采用差异显示逆转录聚合酶链反应（DDRT—PCR）的方法寻找肝脂素诱导前与诱导16、20h后的基因表达差异片段，并对其进行克隆分析。结果250μg/ml肝脂素作用KG-1细胞16、20h细胞凋亡率分别为13．5％和30．4％，显著高于未经肝脂素诱导组（1．5％）。肝脂素诱导KG-1细胞凋亡前后存在明显的基因表达差异，Wnt13和ATPase 3基因是肝脂素诱导KG-1细胞凋亡相关下调基因。结论肝脂素诱导KG-1细胞凋亡，其机制是一个多基因参与的过程。肝脂素诱导KG-1细胞凋亡与Wnt13和ATPase 3基因有关。Wnt13基因在多种肿瘤细胞中高表达，在白血病细胞系中被检测到尚属首次。