AY358935基因抗水疱口炎病毒的作用及其机制探讨

目的初步探讨本课题组前期克隆的AY358935基因对水疱口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的作用及机制。方法将构建完整的pcDNA3.1-AY358935质粒及pcDNA3.1空载体分别稳定转染HEK293细胞,并以VSV感染已转染上述基因或空白的HEK293细胞,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.001。蚀斑分析法检测以上3组细胞上清液中不同时间点的病毒滴度,感染VSV 24 h后用台盼蓝排斥试验检测各组细胞死亡率;对稳定转染目的基因的细胞提取总RNA,进行全基因组cDNA芯片分析。结果①病毒滴度:感染VSV 12 h后,pcDNA3.1-AY358935组细胞上清病毒滴度较pcDNA3.1组和空白组低。18 h时3组病毒滴度分别为(7.16±2.33)×10^5 PFU/mL、(6.25±2.05)×10^6 PFU/mL、(7.75±2.54)×10^6 PFU/mL,pcDNA3.1-AY358935组细胞上清病毒滴度与其余两组的差异接近10倍(P<0.01);②细胞死亡率:病毒感染24 h后,pcDNA3.1-AY358935组、pcDNA3.1组和空白组的细胞死亡率分别为(35.00±6.68)%、(78.33±15.03)%和(83.34±14.98)%,pcDNA3.1-AY358935组的细胞死亡率较其余两组降低(P<0.01);③基因芯片分析结果:与pcDNA3.1空载体组比较,稳定转染pcDNA3.1-AY358935的细胞有30个基因表达上调在3倍以上,其中,干扰素激活基因、干扰素效应基因、细胞因子与趋化因子所占比例分别为27%、17%、20%。结论 AY358935基因具有抗VSV作用,其机制可能涉及干扰素相关的天然免疫应答。

AY358935基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。方法以逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增AY358935基因的cDNA，将该片段克隆进pGEM-Teasy载体；以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3．1-Ay真核表达质粒，并进行双酶切鉴定。以pcDNA3．1-Ay瞬时转染M14细胞，Western印迹法和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di_phenytetrazoliumromide，MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。结果RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小，与pcDNA3．1诅y克隆区酶切片段-致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序，结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、peDNA3．1和脂质体48h后，AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组，且AY358935基因组细胞A值（0．74）也明显高于其余两组（0．39和0．46），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3．1-Ay构建成功，AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。