新基因AY358935的生物信息学分析及功能预测

目的对新基因AY358935的功能性质进行生物信息分析,为深入研究该基因功能奠定基础。方法利用生物信息学分析软件,分析新基因AY358935及其编码蛋白的性质、定位、结构、表达谱等特征,并根据相关信息预测其生物学功能。利用Western blotting检测病毒感染早期AY358935的表达变化。结果AY358935基因进化保守,与马、小鼠、斑马鱼、非洲爪蟾的相似性分别为74%、60%、38%、33%。亚细胞定位于线粒体的可能性大。含有一个N末端信号肽序列和单次跨膜结构,多个磷酸化位点,二级结构主要是α螺旋和无规则卷曲。在正常组织和癌组织表达广泛,并受双链RNA依赖蛋白激酶的表达调控。AY358935蛋白表达在水泡性口炎病毒感染2h后即明显上调。结论初步预测AY358935为具有重要功能的小分子分泌蛋白,可能参与细胞增殖和抗病毒天然免疫调控。

AY358935基因抗水疱口炎病毒的作用及其机制探讨

目的初步探讨本课题组前期克隆的AY358935基因对水疱口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的作用及机制。方法将构建完整的pcDNA3.1-AY358935质粒及pcDNA3.1空载体分别稳定转染HEK293细胞,并以VSV感染已转染上述基因或空白的HEK293细胞,感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.001。蚀斑分析法检测以上3组细胞上清液中不同时间点的病毒滴度,感染VSV 24 h后用台盼蓝排斥试验检测各组细胞死亡率;对稳定转染目的基因的细胞提取总RNA,进行全基因组cDNA芯片分析。结果①病毒滴度:感染VSV 12 h后,pcDNA3.1-AY358935组细胞上清病毒滴度较pcDNA3.1组和空白组低。18 h时3组病毒滴度分别为(7.16±2.33)×10^5 PFU/mL、(6.25±2.05)×10^6 PFU/mL、(7.75±2.54)×10^6 PFU/mL,pcDNA3.1-AY358935组细胞上清病毒滴度与其余两组的差异接近10倍(P<0.01);②细胞死亡率:病毒感染24 h后,pcDNA3.1-AY358935组、pcDNA3.1组和空白组的细胞死亡率分别为(35.00±6.68)%、(78.33±15.03)%和(83.34±14.98)%,pcDNA3.1-AY358935组的细胞死亡率较其余两组降低(P<0.01);③基因芯片分析结果:与pcDNA3.1空载体组比较,稳定转染pcDNA3.1-AY358935的细胞有30个基因表达上调在3倍以上,其中,干扰素激活基因、干扰素效应基因、细胞因子与趋化因子所占比例分别为27%、17%、20%。结论 AY358935基因具有抗VSV作用,其机制可能涉及干扰素相关的天然免疫应答。

AY358935基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建AY358935基因的真核表达质粒并进行初步鉴定。方法以逆转录聚合酶链反应（reverse transcription—polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增AY358935基因的cDNA，将该片段克隆进pGEM-Teasy载体；以测序正确的pGEM-T-AY重组质粒为模板构建pcDNA3．1-Ay真核表达质粒，并进行双酶切鉴定。以pcDNA3．1-Ay瞬时转染M14细胞，Western印迹法和3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di_phenytetrazoliumromide，MTT]比色法分别检测转染细胞AY358935蛋白表达水平及细胞增殖力。结果RT-PCR扩增片段符合AY358935基因cDNA大小，与pcDNA3．1诅y克隆区酶切片段-致。对pGEM-T-AY质粒克隆区测序，结果也与AY358935基因cDNA序列相同。M14细胞分别转染AY358935基因、peDNA3．1和脂质体48h后，AY358935基因组蛋白表达水平明显高于其余两组，且AY358935基因组细胞A值（0．74）也明显高于其余两组（0．39和0．46），差异有统计学意义（P〈0．05）。结论AY358935基因的真核表达质粒pcDNA3．1-Ay构建成功，AY358935基因可能具有促进M14细胞增殖的作用。

新基因AY358935对B16细胞小鼠体内外生长的影响

目的:探讨新基因AY358935对小鼠黑色素瘤B16在细胞小鼠体内外生长的影响及其可能的机制。方法:构建小鼠AY358935基因真核表达质粒并稳定转染B16细胞。MTT法检测AY358935转染细胞(B16-m AY细胞)、空质粒pc DNA3.1转染细胞(B16-pc DNA3.1细胞)及未转染的B16细胞的体外增殖活性。将B16-m AY及B16-pc DNA3.1细胞分别腹背皮下接种于C57小鼠,观察两组成瘤情况。MTT法检测B16-m AY细胞培养上清对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响。结果:B16-m AY细胞的体外增殖活性明显高于B16-pc DNA3.1细胞及对照B16细胞(P<0.05)。B16-m AY细胞移植瘤体积较B16-pc DNA3.1组明显增大(P<0.05)。B16-m AY细胞培养上清组HUVEC增殖活性明显高于B16-pc DNA3.1培养上清组(P<0.05)。结论:AY358935具有促进B16细胞生长的作用,其机制可能涉及促血管生长。

AY245441基因在小鼠腭突发育和腭裂形成中的动态表达

背景与目的：观察AY245441基因在正常腭组织和全反式视黄酸诱导的小鼠腭裂形成过程中的表达变化，探讨AY245441基因的表达在腭突正常发育和腭裂发生中的作用。材料与方法：利用Real-timePCR和原位杂交方法动态检测正常腭组织和全反式视黄酸诱导的腭裂组织中AY245441基因的表达情况。结果：Real-timePCR结果表明，AY245441基因在GD11～16正常腭突和腭裂组织中均有表达，在正常腭中GD11，GD13和GD14时AY245441表达丰度最高，与其它胚龄相比较差异具有统计学意义（P〈0．05）；腭裂组中AY245441的表达丰度明显低于正常腭（P〈0．05），而在腭裂组织中各胚龄AY245441的表达丰度差异无统计学意义（P〉0．05）。原位杂交结果显示，AY245441基因在GD13正常腭板前部的上皮细胞，GD14腭板前部上皮细胞和间充质细胞中均有表达；在GD14正常腭板后部上皮细胞中有少许表达，但间充质细胞中无表达。在GD13腭裂前部上皮细胞中表达量明显下降，在GD14腭裂前部上皮细胞和间充质细胞中表达受到明显抑制，几乎未检出阳性信号；在GD14腭裂后部上皮细胞和间充质细胞中均无表达。结论：AY245441基因在小鼠腭突组织的生长发育中行使重要功能，与腭裂的发生有密切的关系。

GUS基因瞬时表达检测小麦1Ay基因启动子功能

本试验以pAyGUS为转化质粒,该质粒为小麦高分子量麦谷蛋白亚基基因1Ay的启动子和β-葡糖苷酸酶(GUS)基因的重组质粒,利用基因枪法将该质粒导入小麦胚乳及胚中,检测其表达活性。通过X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦种子中特异表达,可见小麦1Ay基因的启动子具有在小麦胚乳中特异表达的活性,这为小麦品种改良及转基因研究奠定了基础。

血清学表型为Ay个体的基因分析

目的研究Ay亚型个体红细胞上血型抗原弱表达的原因,旨在揭示其分子学特征。方法对血清学表型为Ay的个体,通过PCR-SSP进行基因分型,并且测序分析7个外显子和部分内含子,与A101等位基因参比序列对比。结果血清学表现为Ay的个体,PCR-SSP基因分型定为A102/A102,序列分析发现存在A102特异性突变467C>T,同时还发现1009A/G杂合,Interon5的517位二条链均有缺失,一条缺G,一条缺C(517G-/C-)。结论Ay型的分子遗传学背景复杂,467C>T突变、1009A/G杂合、Interon5的517G-/C-缺失尚不足以解释其红细胞上抗原的弱表达。

多发性骨髓瘤中新的表达上调Alu超基因家族成员在不同肿瘤组织中的表达分析

目的 :分析多发性骨髓瘤患者中表达上调基因在正常组织及不同类型实质性肿瘤组织中的表达。方法 :运用RNA点杂交、半定量RT -PCR方法分析AY0 94 6 12在肿瘤组织与正常组织中的表达差异。结果 :多组织表达膜杂交结果显示AY0 94 6 12在各种正常组织以及几种癌细胞系中均有表达。RNA点杂交及半定量RT -PCR均显示AY0 94 6 12在直肠癌、肺癌、脑瘤组织中均表达水平上调 ,其它如胃癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌患者的组织中亦有部分表达水平上调。结论 :AY0 94 6 12的表达上调可能是恶性肿瘤发生的一个重要因素。

卢氏绿壳蛋鸡壳色性状的AY493302标记

卢氏鸡是我国唯一片羽型的可产绿壳蛋的地方鸡种,壳色有绿壳和褐壳2种颜色。本研究采集131只卢氏绿壳蛋鸡,45只卢氏褐壳蛋鸡及18只地方白壳蛋鸡的血液,提取基因组DNA,用微卫星AY493302标记探讨了这3种壳色的基因型差异。结果表明,微卫星AY493302在卢氏绿壳蛋鸡、卢氏褐壳蛋鸡以及地方白壳蛋鸡之间基因型分布差异极显著,基因型AA(225bp/225bp)在卢氏鸡中的频率为0.396 9,且只在卢氏绿壳蛋鸡中出现。其A基因频率在卢氏绿壳蛋鸡、卢氏褐壳蛋鸡和地方白壳蛋鸡中分别为0.698 5,0.500 0,0.500 0。进一步进行测序发现,卢氏绿壳蛋鸡AA基因型在19bp处碱基和217bp处碱基均为G,但卢氏绿壳蛋鸡AB基因型在19bp处碱基却为C,在217bp处碱基与绿壳蛋鸡AA基因型同为G。卢氏褐壳蛋鸡AB基因型和地方白壳蛋鸡的AB基因型则表现在19bp处碱基为C,217bp处碱基为T。AA基因型的序列与NCBI数据库中红色原鸡比较,达99%同源的序列有V00425.1、J02015.1和NW_003763484.1,均位于鸡的1号染色体上。该微卫星标记的群体杂合度、群体多态信息含量在卢氏绿壳蛋鸡中都低于卢氏褐壳蛋鸡和地方白壳蛋鸡。尽管在所研究的卢氏绿壳群体中只有39.7%的个体表现为纯合AA基因型,但卢氏褐壳蛋鸡和地方白壳蛋鸡中没有该基因型,故而认为微卫星AY493302的纯合AA基因型可以作为对卢氏绿壳蛋鸡进行分子标记辅助选择的基因型。