腐胺对小鼠成纤维细胞中Atp8a1基因表达的影响

目的:研究腐胺对小鼠成纤维细胞中Atp8a1基因表达的影响,初步探讨其作用机制。方法:用基因芯片和Real-timePCR检测正常小鼠和Azin1(Antizyme inhibitor 1)基因敲除小鼠肝脏组织中Atp8a1基因的在mRNA水平上的表达;构建Atp8a1基因启动子的虫荧光素酶报告质粒pGL3-Atp8a1-P;将重组质粒转染NTH3T3成纤维细胞中,分别在含有4μg/ml腐胺和不含腐胺的条件下,用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶活性。结果:在含有腐胺的培养条件下,转染Atp8a1基因启动子虫荧光素酶报告质粒的细胞虫荧光素酶的活性明显改变。结论:腐胺能够抑制Atp8a1基因启动子活性而降低其在NIH3T3成纤维细胞中的表达。

AZIN1慢病毒的制备及EC109稳定感染细胞株的建立

目的:制备野生型和编辑型AZIN1的慢病毒并建立稳定感染的食管癌EC109细胞株。方法:用RT-PCR法从人食管鳞状细胞癌组织中扩增出AZIN1基因的c DNA序列,选取测序结果中目标位点的A峰与G峰均高且与NCBI公布的基因编码序列一致的PCR产物,克隆至慢病毒表达载体p Lenti6/V5-D-TOPO,构建野生型和编辑型AZIN1的重组慢病毒表达载体,经酶切和测序鉴定后,经293FT细胞包装,制备相应的慢病毒,然后感染EC109细胞株,行RT-PCR、测序和Western blot鉴定稳定感染的EC109细胞株。结果:双酶切重组慢病毒表达载体后产生了1 347 bp和6 915 bp的片段,经测序证实1 347 bp片段为正确的AZIN1基因编码序列;RT-PCR、测序和Western blot结果证实成功建立了稳定感染的EC109细胞株。结论:成功制备了野生型和编辑型AZIN1的慢病毒并建立了稳定感染的EC109细胞株。