埃及伊蚊表皮结构基因AaCPR100A序列特征和表达特性分析

Aa CPR100A是本实验室从埃及伊蚊RNAseq数据库中获得的预测与表皮结构相关的基因。本文拟通过生物信息学和分子生物学技术,探究埃及伊蚊表皮Aa CPR100A基因的序列特点,并分析其在埃及伊蚊的时空表达特征。埃及伊蚊表皮Aa CPR100A蛋白序列Aa CPR100A ORF长度为765 bp,编码254个氨基酸,蛋白分子量约为28.6 k Da,1~16位氨基酸残基为信号肽,其氨基酸序列中含有表皮蛋白CPR家族中的RR-1基序。埃及伊蚊与白纹伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊和黑腹果蝇的氨基酸同源性分别为95%、72%、61%、54%。qRT-PCR结果显示Aa CPR00A基因在表皮和卵期表达量最高,并随发育阶段呈现显著递减变化。结果表明,埃及伊蚊Aa CPR100A表达具有时空和组织特异性特征。

利用无缝克隆方法构建埃及伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A双向启动子苏云金芽孢杆菌穿梭载体

目的 构建表达dsRNA的双向启动子以及靶基因AaCPR100A的大肠杆菌-苏云金芽孢杆菌穿梭载体pHT315-AaCPR100A。方法 以苏云金芽孢杆菌pSVP27A质粒为模板通过PCR扩增苏云金芽孢杆菌Cry3A正向启动子Pro-1(+);以埃及伊蚊RNA反转为cDNA为模板,扩增靶基因AaCPR100A;将大肠-苏云金穿梭载体pHT315质粒经HindⅢ和SalⅠ双酶切线性化;按照转录方向将正向启动子与靶基因通过无缝克隆插入穿梭载体pHT315中;以生物合成的含有Cry3A反向启动子序列的质粒为模版,经PCR克隆扩增Pro-1(-)反向启动子;将含有正向启动子与靶基因的中间载体通过Eco RⅠ限制性酶切酶线性化,按转录方向在靶基因下游通过无缝克隆插入反向启动子。结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,正向启动子、靶基因AaCPR100A和反向启动子PCR产物条带清晰,质量良好,可用于无缝克隆实验;经无缝克隆连接双向启动子以及靶基因片段后,对含有重组载体pHT315-AaCPR100A的重组质粒进行PCR验证,在重组载体中成功扩增正向启动子、靶基因片段以及反向启动子,经核苷酸测序验证双向启动子序列以及靶基因序列测序结果与序列比对结果基本一致,符合构建载体元件的要求,证明重组载体构建成功。结论 本研究利用无缝克隆技术成功构建含有双向启动子以及靶基因的重组穿梭载体,为构建表达伊蚊表皮蛋白基因AaCPR100A dsRNA的苏云金芽孢杆菌工程菌奠定基础。

埃及伊蚊表皮结构蛋白AaCPR100A的抗原表位的生物信息学预测

【目的】预测埃及伊蚊Aedes aegypti表皮结构蛋白AaCPR100A的抗原表位。【方法】通过DNAStar 8的Protean软件对埃及伊蚊表皮结构蛋白AACPR100A的二级结构和亲疏水性、表面可及性、柔韧性等特性进行分析,预测其潜在的B细胞抗原表位和潜在的T细胞抗原表位。【结果】AaCPR100A蛋白的二级结构以转角和不规则卷曲为主,表面可及性、柔韧性较强,存在7个潜在的B细胞抗原表位,位于18-29、32-42、47-82、87-98、111-178、194-248氨基酸残基或其附近,同时有11个潜在的T细胞抗原表位,位于20-24、35-39、44-48、51-53、79-82、103-106、109-112、146-148、150-152、185-203、224-235氨基酸残基或其附近。【结论】AaCPR100A蛋白潜在的B细胞抗原表位有7个,潜在的T细胞抗原表位有11个,综合后有3个潜在抗原表位,预测结果将为进一步研究AaCPR100A蛋白的免疫学特性和功能奠定基础,并为蚊虫的控制提供潜在的靶标。