Ac⁃SDKP抑制SPP1/TGF⁃β1信号拮抗实验性矽肺的机制

目的探讨N⁃乙酰基⁃丝氨酰⁃天门冬酰⁃赖氨酰⁃脯氨酰(Ac⁃SDKP)通过调节分泌性磷蛋白1(SPP1)/转化生长因子1(TGF⁃β1)信号,从而抑制实验性矽肺的作用及其机制。方法Wistar大鼠分为对照24周组、矽肺24周组和Ac⁃SDKP治疗组。RWA264.7细胞分为对照组、SiO_(2)诱导组和SiO2+Ac⁃SDKP组;以及对照组、重组SPP1诱导组、SPP1+Ac⁃SDKP组和SPP1+LY364947组。免疫组织化学染色(IHC)检测SPP1的表达以及定位;免疫印迹法检测I型胶原(COL I)、巨噬细胞趋化蛋白⁃1(MCP⁃1)、TGF⁃β1、转化生长因子I型受体(TGFβRI)、TGFβRII、p⁃Smad2/3、Smad2/3和SPP1的表达。结果IHC及免疫印迹结果显示,与对照组比较,矽肺模型组COL I、MCP⁃1、TGF⁃β1和SPP1表达上调,与矽肺模型组比较,Ac⁃SDKP治疗组COL I、MCP⁃1、TGF⁃β1和SPP1的表达降低(P<0.05)。与对照组比较,SiO2诱导组COL I、MCP⁃1、TGF⁃β1和SPP1蛋白表达水平上调;与SiO2诱导组比较,Ac⁃SDKP组COL I、MCP⁃1、TGF⁃β1和SPP1蛋白表达水平下调(P<0.05)。与对照组比较,SPP1诱导组TGFβRI、TGFβRII和p⁃Smad2/3表达上调;与SPP1诱导组比较,Ac⁃SDKP组和LY364947组TGFβRI、TGFβRII和p⁃Smad2/3表达下调(P<0.05)。结论Ac⁃SDKP可以通过抑制SPP1/TGF⁃β1信号通路发挥抗矽肺纤维化的作用。

Ac-SDKP对Ang Ⅱ诱导的大鼠血管外膜成纤维细胞胶原合成的调节作用

目的:探讨抗纤维化短肽N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)经由Ang Ⅱ介导的细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)的调节通路在大鼠血管纤维化形成中的作用。方法:采用差速贴壁法获取新生大鼠血管外膜成纤维细胞,随机分为对照组,Ang Ⅱ(10-6mmol/L)组,Ang Ⅱ+Ac-SDKP(10-9mmol/L)组和PD98059(细胞外信号调节激酶通路特异性抑制剂)(25μmmol/L)组,分别采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测I、ⅡI型胶原蛋白mRNA表达,Western blot印迹法检测MMP(基质金属蛋白酶)-2、TGF(转化生长因子)-β1蛋白的表达。结果:Ac-SDKP能显著抑制Ang Ⅱ刺激的胶原蛋白合成和TGF-β1蛋白表达,并上调MMP-2表达。ERK1/2通道特定阻断剂(PD98059)则明显减弱Ac-SDKP的上述作用。结论:Ac-SDKP可能是通过ERK1/2信号转导通道抑制Ang Ⅱ刺激的胶原蛋白合成,从而发挥有效的抗血管纤维化作用。

TGF-1β和MMP-2/MMP-9mRNA在PQ中毒鼠肺中的表达及Ac-SDKP保护作用

目的探讨TGF-1β和MMP-2/MMP-9mRNA在PQ中毒鼠肺中的表达及Ac-SDKP保护作用。方法实验分为Ac-SDKP治疗组(60只),对照组(C30只)、百草枯中毒组(PQ60只)。PQ组按照25 mg/kg标准给予百草枯灌胃造模,C组灌胃生理盐水。Ac-SDKP治疗组:造模后1 h腹腔埋入含Ac-SDKP[800μg/(kg·d)]的微量缓释泵;PQ组、C组分别予生理盐水。以6 h、12 h、1 d、3 d、5 d、7 d为研究点处死实验鼠,C组每次5只,其它组每次10只。对实验鼠肺泡炎症程度、间质水肿、肺不张和肺纤维化形成分别进行评分,实验鼠肺组织TGF(转化生长因子)-1β和MMP-2/MMP-9mRNA的表达检测分别采用酶联免疫法(ELISA)方法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测。结果与对照组相比,PQ组肺组织损伤明显,TGF-1β的表达升高,MMP-2/MMP-9mRNA的表达上调(P <0.05),Ac-SDKP组能抑制这种变化;TGF-1β与MMP-2/MMP-9 mRNA表达呈正相关(r1=0.71,r2=0.87,P <0.01)。结论 Ac-SDKP可能也是通过对TGF-1β和MMP-2/MMP-9 mRNA基因表达的调节,来保护百草枯中毒所致肺损伤。

Ac-SDKP对炎性因子MRP-14(S100A9)的调节在硅肺大鼠纤维化病变中的作用

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是否通过抑制炎性因子髓系相关蛋白14(myeloid-related protein14,MRP-14)以及胶原蛋白的表达,从而阻抑硅肺大鼠纤维化病变中硅结节的形成和胶原蛋白的沉积。方法采用一次性支气管灌注二氧化硅(SiO 2)粉尘的方法制备大鼠硅肺动物模型,60只SPF级健康成年大鼠随机分为对照4周组、对照8周组、硅肺模型4周组、硅肺模型8周组、Ac-SDKP预防治疗组和Ac-SDKP抗纤维化治疗组,每组10只。免疫组织化学技术检测MRP-14蛋白在硅肺模型组织内的定位表达;Western blot法检测MRP-14以及胶原蛋白在硅肺模型组织内的表达。结果与相应的对照组相比,硅肺模型组大鼠硅肺纤维化区域MRP-14和胶原蛋白的表达增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。与硅肺模型8周组相比,给予Ac-SDKP干预后MRP-14和胶原蛋白表达明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Ac-SDKP可通过抑制炎性因子MRP-14的表达而发挥其抗硅肺纤维化的作用。

Ac-SDKP抑制YEATS4拮抗实验性矽肺的机制

目的研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酰(N-acetyl-seranyl-aspartate-lysyl-proline,AcSDKP)通过调节含YEATS结构域蛋白4(YEATS domain containing protein 4,YEATS4)从而抑制矽肺纤维化的作用及其机制。方法 RAW264.7细胞分为si RNA阴性对照组(si RNA-Control,si C)、si RNA-YEATS4组(siY)、SiO_(2)+si RNA阴性对照组(S+si C)和SiO_(2)+si RNA-YEATS4组(S+siY);以及对照组(Control,C)、SiO_(2)诱导组(SiO_(2),S)、SiO_(2)+Ac-SDKP处理组(SiO_(2)+Ac-SDKP,S+Ac)和Ac-SDKP处理组(Ac)。Wistar大鼠分为对照24周组(Control 24week,C24)、矽肺24周组(Silicosis 24 week,S24)和Ac-SDKP治疗组(Ac-SDKP treatment 24 week,Ac24)。免疫印迹法(Western blot)检测I型胶原(Collagen type I,COL I)、巨噬细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、精氨酸酶-1(Arginase-1)和YEATS4的表达。免疫组织化学染色法(Immunohistochemical staining,IHC)检测YEATS4在肺组织中的定位及表达。结果 Western blot结果显示,在RAW264.7细胞中,分别与si C、S+si C组比较,siY组、S+siY组COL I、MCP-1、Arginase-1表达均明显降低(P<0.05);与C组比较,S组COL I、MCP-1、Arginase-1和YEATS4高表达;与S组比较,S+Ac组中COL I、MCP-1、Arginase-1和YEATS4表达降低(P <0.05)。IHC及Western blot结果显示,与C24组大鼠比较,S24组中COL I、MCP-1、Arginase-1和YEATS4表达上调;与S24组比较,Ac24组中COL I、MCP-1、Arginase-1和YEATS4表达降低(P<0.05)。结论 Ac-SDKP可能通过抑制YEATS4发挥抗矽肺纤维化的作用。

Ac-SDKP对TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:观察氮乙酰丝氨酰天冬氨酰赖氨酰脯氨酸(Acetyl-N-ser-asp-lys-pro,Ac-SDKP)对肾小管上皮细胞表达胸腺肽β4(Thymosinβ4,Tβ4)及上皮间充质转分化(Epithelial-mesenehymal transition,EMT)的影响,探讨Ac-SDKP与肾小管上皮细胞EMT及Ac-SDKP之间的关系。方法:用转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导大鼠肾小管上皮细胞发生EMT后,再予外源性不同浓度的Ac-SDKP干预,通过细胞免疫组化染色的方法检测肾小管上皮细胞Tβ4和α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)表达。结果:1.TGF-β1(5 ng/mL)刺激48 h后肾小管上皮细胞形态明显拉长,呈梭长形,似成纤维细胞;予Ac-SDKP(10 nmol/L)干预后,细胞形态似有恢复类圆形,但未恢复至正常的细胞形态;2.在空白组,Tβ4在肾小管上皮细胞胞浆及胞核内表达,平均光密度(OD)值为(0.203±0.009);α-SMA仅在肾小管上皮细胞胞浆内微量表达,OD值为(0.184±0.007);TGF-β1刺激组Tβ4和α-SMA表达显著升高,OD值分别为(0.346±0.016)和(0.345±0.008),与空白组比,差异均有统计学意义(P<0.05);3.TGF-β1+卡托普利组Tβ4及α-SMA表达减少,OD值分别为(0.337±0.021)和(0.334±0.023),与TGF-β1刺激组比,差异均无统计学意义(P>0.05);4.Ac-SDKP为0.1、1、10nmol/L时,Tβ4和α-SMA表达均下降,且与TGF-β1刺激组比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中10 nmol/L下降最显著,OD值分别为(0.237±0.008)和(0.225±0.018);5.肾小管上皮细胞中Tβ4和α-SMA的表达量之间存在直线正相关关系(r=0.995,P<0.01)。结论:TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT后,Tβ4在肾小管上皮细胞内表达明显上调,予不同浓度的Ac-SDKP刺激后,Tβ4表达下调,在10 nmol/L Ac-SDKP时下降最为显著。

Ac-SDKP生物学效应与机制的研究进展

N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)是由胸腺素β4通过内肽酶-α和脯氨酰寡肽酶连续水解后产生的内源性短肽,具有免疫调节、促进血管生成、肿瘤发生和拮抗器官纤维化的作用。本文根据我们部分研究结果和近年来相关的文献,就Ac-SDKP研究进展进行综述。

Ac-SDKP通过抑制内质网应激对肺纤维化细胞凋亡的影响

目的探讨体内、外肺间质纤维化模型中Ac-SDKP延缓肺纤维化发展的可能机制。方法体内实验:将24只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组(8只)、肺纤维化模型组(8只)、肺纤维化+Ac-SDKP治疗组(8只)。采用气管内注入博来霉素(5 mg/kg)法建立小鼠肺纤维化模型,对照组为气管内注入等体积0.9%氯化钠溶液。造模后肺纤维化+Ac-SDKP治疗组小鼠腹腔内埋入Ac-SDKP微量注射泵(Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1),冰乙酸0.1 mol/L,卡托普利100 mg·kg^(-1)·d^(-1)),持续干预21 d。对照组及肺纤维化模型组小鼠均于造模完成后第21天处死,肺纤维化+Ac-SDKP治疗组小鼠于干预21 d后处死,取肺组织观察其病理学变化;按试剂盒说明测定羟脯氨酸含量测定;TUNEL法测定肺泡上皮细胞凋亡率;Western-blot、免疫组化法检测GRP78、CHOP蛋白及mRNA的表达水平。体外实验:培养A549细胞,经TGF-β干预24 h后收集细胞,RT-PCR检测GRP78、CHOP mRNA的表达水平。正态分布计量资料多组间比较釆用方差分析,两两比较采用SNK-q检验;非正态分布计量资料多组间比较采用kruskal-WallisH检验。结果(1)一般观察:对照组小鼠双肺表面及切面光滑,未见结节形成;肺纤维化模型组肺组织表面及切面可见散在小结节;肺纤维化+Ac-SDKP治疗组肺组织表面也可见小结节,但较肺纤维化模型组稀少。(2)HE及Masson染色:肺纤维化模型组出现明显的纤维化改变,肺纤维化+AC-SDKP治疗组肺纤维化程度有所减轻。(3)羟脯氨酸含量3组间羟脯氨酸含量差异有统计学意义(H-20.490,P<0.01),其中肺纤维化模型组、肺纤维化+Ac-SDKP治疗组明显高于对照组(q-0.517、0.167,P<0.05),肺纤维化+Ac-SDKP治疗组明显低于肺纤维化模型组(q-0.351,P<0.05)。(4)肺泡上皮细胞凋亡指数:3组间差异有统计学意义(F-57.720,P<0.01),其中肺纤维化模型组、肺纤维化+Ac-SDKP组明显高于对照组(q-8.471、3.639,均P<0.01),肺纤维化+Ac-SDKP组明显低于肺纤维化模型组(q-4.832,P<0.01)。(5)CHOP、GRP78蛋白水平表达:肺纤维化模型组、肺纤维化+Ac-SDKP治疗组较对照组明显下降(q-22.630、8.921,138.812、41.233;P<0.01),肺纤维化+Ac-SDKP治疗组较肺纤维化组明显升高(q-13.711、97.583,P<0.01)。(6)GRP78、CHOP mRNA表达量:TGF-β干预组较对照组明显升高(q-8.791、7.782,P<0.05);TGF-β+AC-SDKP干预组较单纯Ac-SDKP干预组明显升高(q-4.399、5.561,P<0.05)。结论 Ac-SDKP可能通过抑制内质网应激减缓肺泡上皮细胞凋亡,从而发挥其抗肺间质纤维化的作用。

化学合成的Ac-SDKP类似物FAM-Aca-SDKP与HSC-T6细胞表面结合特征分析

目的 利用化学合成N-乙酰基-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸（Ac-SDKP）类似物FAM-Aca-SDKP,探讨Ac-SDKP与肝星状细胞株（HSC-T6细胞）的结合及其结合的基本物理特征.方法 化学合成携带绿色荧光的Ac-SDKP类似物短肽[5-FAM]-酪氨酸-氨基己酸-丝氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-脯氨酸（FAM-Aca-SDKP）,实时定量PCR检测其对HSC胶原分泌影响验证其生物学效应与Ac-SDKP一致性,采用荧光显微镜观察FAM-Aca-SDKP与HSC-T6结合,采用流式细胞术检测FAM-Aca-SDKP与HSC-T6结合的时间-浓度效应.据资料不同采用t检验或秩和检验进行统计学分析.结果 不同浓度的Ac-SDKP及FAM-Aca-SDKP与HSC-T6孵育24 h后,均观察到HSC-T6表达Ⅰ型前胶原增加,而作用时间为0.5h时,Ac-SDKP和FAM-Aca-SDKP导致Ⅰ型胶原表达分别下降30％ ～ 50％;FAM-Aca-SDKP与HSC-T6共孵育后,在荧光显微镜下观察到细胞表面出现显著绿色荧光,给予Ac-SDKP竞争抑制可显著减少细胞表面的荧光强度;流式细胞术检测显示,在FAM-Aca-SDKP浓度为0 ～ 50 μ mol/L时,荧光阳性细胞率从0快速上升至约12％,而在浓度为50 ～ 100μ mol/L,阳性细胞率仅从约12％上升至约14％,并且给予Ac-SDKP共孵育可显著降低阳性细胞百分率;FAM-Aca-SDKP阳性细胞数在孵育45 min达到高峰,随后逐渐降低. 结论 FAM-Aca-SDKP可结合于HSC-T6细胞表面,表现出竞争性抑制、可饱和、时间-浓度效应等配体-受体结合特征.

Ac—SDKP在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠中作用机制的探讨

目的 探讨小鼠肺间质纤维化（IPF）模型中，Ac-SDKP通过抑制内质网应激（ERS）进而干预上皮-间质转化（EMT）过程而延缓肺纤维化发展的机制。方法 将24只9周龄健康雄性C57BL/6小鼠（体重25±2g）随机分为3组：正常对照组（N组，n=8只）、肺纤维化模型组（M组，n=8只）、肺纤维化＋Ac-SDKP治疗组（P组,n=8只）。选取其中16只小鼠，采用气管内注入博来霉素（5mg/kg）法建立小鼠肺纤维化模型，21天后随机选取8 只纤维化小鼠，腹腔内埋入Ac-SDKP微量注射泵（内含Ac-SDKP混合溶液：Ac-SDKP 800ug/kg.d，冰乙酸0.1M，卡托普利100mg/kg.d），持续干预21天。于各组造模21天后处死小鼠，取肺组织，观察肺组织病理学变化；羟脯氨酸含量测定，判断造模是否成功并评估肺组织纤维化严重程度；Western-blot、免疫组化法检测内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP，间质组织标志物α-SMA、Vementin，上皮组织标志物E-cadherin蛋白表达水平。结果 1、肉眼观察：N组双肺表面及切面光滑，未见结节形成；M组双肺表面及切面均可见散在结节性病变；P组肺组织表面也可见小结节，但较M组稀少。2、HE及Masson 染色：M组出现明显的纤维化改变。P组与M组相比，肺泡炎及肺纤维化的程度均有所减轻（P＜0.05）。3、羟脯氨酸含量测定：M组较N组含量升高；P组较M组含量降低，P组较N组含量仍有所升高（P＜0.05）。4、免疫组化结果：（1）N组肺组织中，α-SMA 、Vimentin、CHOP及Grp78少量表达， M组表达较N组明显增加，P组较M组表达减少，但仍多于N组（P＜0.05）（2）N组肺组织中，E-cadherin表达较多，M组表达较N组减少，P组较M组表达增加，但少于N组（P＜0.05）。5、Western blot 结果：与N组比较，M组CHOP、Grp78、Vimentin表达量均升高；Ecadherinn的表达量降低；而P组各指标表达量均介于N组和M组之间（P＜0.05）。 结论 在肺纤维化发病过程中，Ac-SDKP可能通过抑制ERS减缓EMT，从而发挥其抗肺间质纤维化的作用。

抗纤维化Ac-SDKP异构体:改善小鼠心肌梗死后心室重构（英文）

本文主要目的是研究体外合成的Ac-SDKP异构体抗血管紧张素转化酶(ACE)降解的特性及其对心梗后心室重构的影响。我们通过D型氨基酸替代Asp和Lys的方式制备了一个Ac-SDKP小肽的异构体Ac-SDDKDP(中国发明专利ZL201110436671.9),并通过建立心肌梗死小鼠动物模型,培养心肌成纤维细胞,结合流式细胞仪,qRT-PCR,Western Blots等技术评估Ac-SDDKDP对梗死心肌的保护作用。结果发现,Ac-SDDKDP使Ac-SDKP的半衰期从数分钟延长至2小时。AcSDDKDP主要通过抑制梗死心肌中巨噬细胞的旁路激活(Alternative activation,M2),减少TGF-β1、ARG I、胶原蛋白I等一系列分子的分泌来发挥抗纤维化的功能。与对照组小鼠左室短轴缩短率(FS)11.2±6.2相比,Ac-SDDKDP组FS为23.0±7.8,Ac-SDKP组FS为11.7±5.3(P<0.05)。结论:该研究证实Ac-SDKP异构体Ac-SDDKDP通过抑制梗死心肌中巨噬细胞的旁路激活(M2),减少TGF-β1、ARGI分泌发挥治疗缺血性心脏病的药用潜能。

Ac-SDKP对矽肺大鼠磷酸化热休克蛋白27/SNAI1途径的调节作用

目的研究抗纤维化四肽N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)对矽肺大鼠纤维化肺组织中磷酸化热休克蛋白27(P-HSP27)及锌指家族核转录因子1(SNAI1)表达的调控,以探讨Ac-SDKP抗矽肺纤维化作用。方法于2014年12月,采用一次性支气管灌注二氧化硅(SiO_(2))粉尘的方法制备大鼠矽肺动物模型,选取80只SPF级健康成年Wistar大鼠,根据随机数字表法将大鼠分为8组,每组10只。模型对照4周组(饲养4周)、模型对照8周组(饲养8周):支气管灌注生理盐水1.0 ml/只;矽肺模型4周组(饲养4周)、矽肺模型8周组(饲养8周):支气管灌注50 mg/ml的SiO_(2)混悬液1.0 ml/只;单独Ac-SDKP给药4周组(饲养4周)、单独Ac-SDKP给药8周组(饲养8周):Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1)腹腔泵给药;Ac-SDKP预防治疗组:Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1)给药48 h后,支气管灌注SiO_(2)混悬液1.0 ml/只,饲养8周;Ac-SDKP抗纤维化治疗组:支气管灌注SiO_(2)混悬液1.0 ml/只4周后,给予Ac-SDKP 800μg·kg^(-1)·d^(-1)治疗4周。蛋白免疫印迹(Western blotting)检测各组P-HSP27、SNAI1、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),以及Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达,免疫组织化学技术检测P-HSP27和SNAI1的表达,激光共聚焦显微镜检测P-HSP27和α-SMA共定位表达。结果与模型对照组比较,矽肺模型组大鼠矽肺纤维化区域P-HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达增强,差异均有统计学意义(P<0.05)。给予Ac-SDKP干预后,与矽肺模型8周组比较,Ac-SDKP预防和抗纤维化治疗组大鼠P-HSP27、SNAI1、α-SMAⅠ型和Ⅲ型胶原蛋白表达明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。而单独Ac-SDKP给药组与模型对照组P-HSP27、SNAI1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达无明显变化,差异均无统计学意义(P>0.05)。激光共聚焦结果显示,矽肺模型组大鼠肺组织表达P-HSP27和α-SMA的阳性细胞多于模型对照组;与矽肺模型组比较,Ac-SDKP预防和抗纤维化治疗组表达P-HSP27和α-SMA的阳性细胞减少;与模型对照8周组比较,矽肺模型8周组结节中有部分P-HSP27和α-SMA表达的双阳性细胞。结论Ac-SDKP可能通过调节P-HSP27/SNAI1通路发挥抗矽肺纤维化的作用。