重组病毒AcMNPV-BmK IT侵染Sf9细胞后凋亡相关基因的表达分析

将从东亚钳蝎中克隆到的兴奋型昆虫毒素基因(BmK IT)同源重组到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组中,得到重组病毒AcMNPV-BmK IT,抗虫试验表明重组杆状病毒的杀虫活性明显优于野生型病毒,但AcMNPV介导的BmK IT的抗虫分子机制尚未阐明。本试验从草地贪夜蛾Sf9细胞中克隆获得了凋亡相关基因Sfp53,制备了抗体,分析了AcMNPV-BmK IT对Sfp53表达的影响,结果表明被重组病毒感染的细胞所表达的Sfp53时间与表达量与野生型相比都有所提前和提高,说明重组病毒可加速细胞的凋亡;同时通过半定量PCR分析了AcMNPV-BmK IT感染Sf9细胞时病毒抗凋亡基因iap2的表达,结果表明重组型病毒抗凋亡基因iap2表达量减少。以上结果在细胞分子水平上解释了AcMNPV-BmK IT杀虫活性提高的原因。

AcMNPV介导BmKIT和组织蛋白酶协同表达对Sf9细胞凋亡的分析

为了研究Bm K IT提高Ac MNPV抗虫活性的作用机制,将Bm K IT基因插入到Ac MNPV中形成重组病毒。采用重组单价病毒Ac MNPV-Bm K IT(IE1)、Ac MNPV-Bm K IT(P10)、Ac MNPV-Bm K IT(PH)和一种重组双价病毒Ac MNPV-Bm K IT(P10)-vcath(PH),通过四唑盐比色法(MTT)和蛋白质印迹法(Western Blot)分析了Bm K IT在Ac MNPV的3个启动子调控下对Sf9细胞增殖和细胞凋亡的影响,结果显示,感染病毒36,48 h Bm K IT在不同启动子调控下表达量从高到低依次为PH、P10、IE1。同时分析了Ac MNPV介导的Bm K IT与组织蛋白酶的协同表达对昆虫Sf9细胞增殖和调亡的机制,结果表明,Ac MNPV-Bm K IT(P10)-vcath(PH)处理组对Sf9细胞抑制率比Ac MNPV-Bm K IT(P10)处理组平均提高了14.5%,凋亡相关蛋白c-Myc、cleaved-Caspase3、Bax表达量增加,Bcl-2表达量减少。

杆状病毒AcMNPV介导BmK IT的表达促进草地夜蛾卵巢Sf9细胞凋亡及病毒在细胞内的复制(英文)

昆虫杆状病毒是一类寄生于节肢动物的囊膜包裹的双链环状DNA,杆状病毒作为新型生物杀虫剂逐渐应用于害虫防治。BmK IT是一种从东亚钳蝎分离出来的昆虫毒素,可以与昆虫细胞膜的钠离子通道相互作用,引起钠离子通道动作电位重复发放,并增强钠电流峰值,延缓钠传导关闭,使昆虫产生兴奋性麻痹。为了提高杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)杀虫活性,本研究将BmK IT基因插入到AcMNPV基因组中,形成重组杆状病毒AcMNPV-BmK IT。采用MTT法、TUNEL试剂、Western blot、real-time PCR及病毒滴度测定来检测AcMNPVBmK IT对草地夜蛾卵巢细胞Sf9发生凋亡及病毒在Sf9细胞内的复制情况。结果显示AcMNPV介导BmK IT的表达促进了Sf9细胞凋亡及病毒复制。此结果为揭示重组病毒AcMNPV-BmK IT的抗虫机制提供了实验依据。