茶蚕颗粒体病毒AcMNPVORF38同源基因的克隆及序列分析

[目的]为利用昆虫病毒更好地防治害虫和进行分子生物学研究。[方法]从感病茶蚕幼虫的尸体中提取颗粒体病毒DNA后,进行酶切、克隆、测序和序列分析。[结果]成功克隆了茶蚕颗粒体病毒基因组中一个1 484 bp的片段。该片段含有1个完整的开放阅读框(ORF)和2个不完整ORF。完整ORF为666 bp,有典型Nudix结构域,其编码1个与苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒AcMNPV的ORF38高度同源的基因,定名为AcORF38同源基因。2个不完整ORF分别编码p47蛋白基因的C-端和p24基因的N-端。[结论]茶蚕颗粒体病毒与卷蛾科宿主中颗粒体病毒亲源关系较近,而与夜蛾科宿主昆虫中颗粒体病毒较远。AcORF38同源基因与编码NTP焦磷酸水解酶的基因高度同源,可能与病毒的复制和DNA损伤的修复过程相关,也可能与入侵寄主的过程相关。

小麦抗叶锈基因Lr38的一个新标记

【目的】建立小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38特异的PCR标记。【方法】以Thatcher为对照,以TcLr38和TcLr38×Thatcher F2代单株构建的分离群体为材料,利用TcLr38远缘亲本中间偃麦草特异的SCAR标记引物进行PCR扩增获得单一条带,并以50个小麦抗叶锈近等基因系材料对该标记特异性进行检测,Mapmaker3.0软件计算该标记与Lr38的遗传连锁距离。【结果】中间偃麦草特异的SCAR标记引物在TcLr38中获得单一扩增片段大小为982bp,50个小麦抗叶锈近等基因系检测表明为TcLr38的特有条带,F2代分离群体验证表明为与Lr38共分离的分子标记,命名为Y38SCAR982。【结论】Y38SCAR982可以作为Lr38的分子标记,并证实该基因由中间偃麦草向普通小麦转移的事实。

反义p38α基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞炎性因子的表达

目的 探讨反义p3 8α基因转染对缺氧复合烧伤血清处理心肌细胞炎性因子的表达。方法 建立缺氧复合烧伤血清培养心肌细胞模型 ,分对照组、缺氧复合烧伤血清组 (非转染组 )和反义p3 8α基因转染组 (转染组 )。烧伤血清采自 40 %TBSAⅢ度烧伤Wistar大鼠 ;采用含 1%O2 的混合气体造成缺氧模型 ;采用基因重组技术构建反义p3 8α基因重组体 ;用免疫印迹法和RT PCR法分别检测不同时相点p3 8α激酶蛋白及TNFα、IL 1βmRNA表达变化 ,并作统计学分析。 结果 成功构建反义p3 8α基因重组体 ;缺氧复合烧伤血清迅速、持续激活心肌细胞p3 8α激酶 ,心肌细胞TNFα、IL 1β表达增多 ;反义p3 8α基因显著抑制p3 8α激酶过度活化 (P <0 0 1) ,下调TNFα、IL 1β表达 (P <0 0 1)。 结论 p3 8α激酶途径介导了缺氧和烧伤血清所致心肌细胞损伤 ,抑制p3 8α激酶的持续活化能有效下调炎性因子TNFα、IL 1β表达 ,减轻该条件下心肌细胞损害。

增生性瘢痕内p38丝裂素活化蛋白激酶及其MAPKKs基因的表达

为探讨增生性瘢痕和正常皮肤中p3 8丝裂素活化蛋白激酶 ( p3 8MAPK)及其上游信号分子mkk3和mkk6基因表达的变化 ,提取 8例增生性瘢痕和 8例正常皮肤组织的总RNA后 ,分离纯化mRNA ,用RT PCR方法检测这 3种基因在不同组织中的表达变化规律。结果显示 ,在正常皮肤组织中 ,mkk6和p3 8MAPK基因表达较弱 ,而在增生性瘢痕内 ,这 2种基因PCR产物的灰度比分别为正常皮肤的 1 2倍和 1 9倍 ,基因表达量明显升高 (P <0 0 5和P <0 0 1) ,而mkk3在这两种不同类型组织中的表达量没有显著性差异 (P >0 0 5 )。提示增生性瘢痕的发生可能与mkk6和 p3 8MAPK基因表达升高有关 。

p38MAPK基因敲除对亚砷酸盐诱导细胞凋亡的影响

目的:研究p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在应激刺激诱导的细胞凋亡中的作用。方法:p38+/+和p38-/-细胞用NaAsO2刺激后,用多聚甲醛固定及DAPI染核,利用荧光显微镜观察细胞核的形态改变。NaAsO2刺激的p38+/+和p38-/-细胞用Annexin V-FITC与PI双标后,用流式细胞分析仪分析细胞凋亡百分率。结果:NaAsO2刺激后,大部分p38-/-细胞产生典型的凋亡细胞形态学变化,p38+/+细胞仅少数细胞出现核固缩。而且,p38-/-细胞中凋亡细胞百分率较刺激前和p38+/+细胞都显著增加,而p38+/+细胞的凋亡率没有明显变化。结论:p38基因敲除使细胞对亚砷酸盐应激刺激的耐受性下降,容易发生凋亡;p38丝裂原活化蛋白激酶可能在提高细胞的应激适应能力上发挥着重要的作用。

PBX3基因调控p38MAPK信号对肝癌细胞生长及5-氟尿嘧啶化疗敏感性的影响

目的探讨前B细胞白血病同源盒基因(PBX)3基因对肝癌细胞活力、凋亡及5-氟尿嘧啶(5-FU)化疗敏感性的影响及机制。方法以人正常肝细胞HL-7702为对照细胞,Western印迹法检测肝癌Huh7、HepG2、MHCC97H和SMMC7721细胞中PBX3的蛋白表达。以LipofectamineTM2000为载体,参照其转染说明将设计合成的PBX3的特异性siRNA(si-PBX3组)及阴性对照siRNA(NC组)转染SMMC7721细胞,仅加入脂质体的为空白对照组,Western印迹检测转染后的细胞PBX3的蛋白表达。SMMC7721细胞分为NC组、si-PBX3组、5-FU组和si-PBX3+5-FU组,细胞处理48 h,噻唑蓝(MTT)及流式细胞术分别检测4组细胞活力和凋亡率。Western印迹检测细胞增殖核抗原(PCNA)、Bax、p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和p-p38MAPK的蛋白表达。结果 PBX3在肝癌细胞中的蛋白表达均显著高于在HL-7702细胞(P<0.05)。与空白对照组相比,si-PBX3组细胞中PBX3蛋白表达显著降低(P<0.05)。与NC组相比,si-PBX3组和5-FU组细胞活力及p-p38MAPK、PCNA蛋白表达水平均显著降低,而细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平均显著升高(P<0.05);si-PBX3+5-FU组细胞活力及PCNA和p-p38MAPK蛋白表达均显著低于si-PBX3组和5-FU组,细胞凋亡率及Bax的蛋白表达均显著高于si-PBX3组和5-FU组(P<0.05)。结论抑制PBX3基因表达可降低肝癌细胞活力,诱导细胞凋亡,增强肝癌5-FU化疗敏感性,机制可能与下调p38MAPK信号通路有关。

马立克氏病病毒pp38基因启动子和增强子的克隆和序列分析

参考GeneBank发表的马立克氏病病毒(MDV)国际标准强毒株GA的基因序列,设计合成一对引物,分别以RB1B,814,GD2(广东分离株),J 1 E(北京分离株),Md11,Md5,CVI988等不同毒株的MDV基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得了预期大小的PCR产物。该产物经pGEM T easy克隆后测序,将所得序列进行比较分析。结果发现:不同毒株间pp38基因的启动子和增强子序列间有缺失突变,序列的同源性大于95 9%,其中大多数的突变发生在MDV复制的原点附近。

黄淮麦区小麦品种Lr37-Yr17-Sr38基因簇的分子检测

【目的】在分子水平上评价黄淮麦区小麦品种中抗病基因簇Lr37-Yr17-Sr38的存在状况,为培育抗病新品种及抗病品种合理布局提供材料和依据。【方法】利用N基因组特异标记和CAPS标记,结合品种系谱对黄淮麦区126个小麦品种(系)进行分析。【结果】12个小麦品种(系)(兰考906、郑2062、西农739、陕872、小偃216、陕538、陕515、大唐991、户麦928、0020-332、2871和378)中含有Lr37-Yr17-Sr38。【结论】Lr37-Yr17-Sr38在黄淮麦区小麦中有一定分布,初步推测兰考906可能是我国小麦品种中Lr37-Yr17-Sr38抗源的主要传播途径之一。

人CD38抗原胞外段基因克隆及表达

目的 克隆并表达人CD38抗原分子的胞外段基因。方法 采用RT PCR法 ,从高表达CD38抗原的Daudi细胞系中 ,扩增CD38全长cDNA ,并将其插入 pGEM T载体中。重新设计引物 ,从重组 pGEMT载体中 ,扩增CD38抗原分子的胞外段基因 ,再亚克隆到表达载体 pET2 8a(+) ,转化大肠杆菌BL2 1,用IPTG诱导表达。结果 经酶切鉴定及序列分析表明 ,克隆的CD38胞外段基因的序列与文献[1,2 ] 的报道完全一致。将该片段亚克隆到表达载体 pET2 8a(+) ,经IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1中获得表达。结论 获得了人CD38抗原分子胞外段基因及其原核表达产物 ,对进一步制备单克隆抗体。

不同发育阶段大鼠小肠上皮细胞c-jun、p38基因表达的特征及其与肠损伤修复的关系

目的 :研究原癌基因 c jun及其相关基因 p38在不同发育阶段大鼠小肠上皮细胞的表达分布特征 ,探讨 c jun和 p38基因在小肠创伤修复时可能发挥的生理学作用。方法 :利用超敏的链霉卵白素 (SP)免疫组织化学方法 ,观察 c jun和 p38基因在胚胎、新生及成年各时间段 Wistar大鼠小肠上皮细胞的阳性表达与分布特征。同时以细胞增殖活性的标志增殖细胞核抗原 (PCNA )表达为参照 ,对不同时期细胞的增殖分化状况作对比研究。结果 :在胚胎第 17d(E17d)、E19d及新生期第 1d(P1d)、P2 d、P7d、P14 d和 P2 8d,小肠上皮细胞c jun基因的阳性表达范围广泛 ,并且随着肠绒毛细胞的发育成熟 ,其分布从绒毛及间隙转移至绒毛上部细胞 ;在此期间 ,PCNA阳性细胞主要分布于新生绒毛底部、绒毛间隙、隐窝内的细胞 ;到成年期大鼠 ,c jun基因的表达主要在小肠绒毛顶部 ,而 PCNA阳性细胞也只局限在小肠隐窝。从 E17d至成年期 ,p38的阳性表达主要集中在绒毛间隙和陷窝内核分裂细胞。结论 :在小肠发育的早期 ,原癌基因 c jun在特定位置的高度表达 ,可能与细胞的快速分化有关 ;而其相关基因 p38的表达可能与细胞有丝分裂存在着一定的内在联系。

马立克氏病病毒pp38基因上游的一个双向启动子研究

马立克氏病病毒 (MDV)pp38基因上游是病毒基因组DNA复制原点。在其两侧均含有启动子TATA box、CAAT box等特征性的保守基元 ,推测是一个天然的双向启动子。为了在体外验证其双向启动活性 ,本研究以MD Vpp38为报告基因 ,并将其ORF插入到pUC18中 ,构建了pUC pp38质粒。将包含该启动子完整区域的 789bp序列分别以正反两个方向克隆进pUC pp38质粒中pp38报告基因的上游 ,获得的重组质粒pProfpp38和pProrpp38。将所获得的重组质粒分别转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过间接免疫荧光试验检测pp38基因的表达以验证该启动子的双向启动活性。结果表明 ,马立克氏病病毒复制原点区的启动子无论以何种方向插入pUC pp38质粒中 ,在转染细胞2 4h内能检测到pp38基因的表达 ,4 8h后能获得高效和持续的表达。逐渐缩小该启动子的范围 ,最终在 32 0bp时 ,仍能检测到两个方向较强的启动活性。

应用亲和层析法提纯鸡马立克氏病病毒pp38基因重组产物

利用鸡马立克氏病病毒(MDV)Ⅰ型特异单克隆抗体H_(19)致敏Sepharose 4B-CNBr,从感染重组病毒BP38Ⅱ的昆虫细胞中提纯鸡马立克氏病毒pp38基因重组产物,获得良好效果。提纯的蛋白质在SDS-PAGE中表现出一条分子量约为38kDa的蛋白质条带,在免疫印迹试验中该蛋白质条带也能被单克隆抗体H_(19)识别。利用该提纯的重组pp38免疫小鼠,所制备的小鼠抗血清在免疫荧光染色试验中不仅能与感染重组病毒的昆虫细胞Sf9反应,也能和Ⅰ型MDV型感染的鸡胚成纤维细胞反应。

mRNA差异显示法克隆小鼠精子发生相关基因-p38MAPK基因

目的 克隆 1、2、3、4周龄小鼠睾丸之间差异表达的基因。 方法 应用改良的mRNA差异显示技术 ,对 1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行了基因表达的差异显示分析 ,并对其中 1个从 2周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序。 结果 所克隆的cDNA片段与小鼠大脑、造血干细胞p38MAPK(p38betamitogen activatedpro teinkinase ,p38MAPK β)基因的同源性分别为 91%和 85 %。Northerndotblot结果显示该基因在小鼠睾丸和脑组织中表达最高。

二噁英对HepG2和SPC-A1细胞P53和P38 MAPK基因表达的影响

[目的 ]探讨二英 (TCDD)对人体肝癌细胞株 (HepG2 )和肺腺癌细胞株 (SPC A1)中P5 3基因和P3 8MAPK基因表达的影响 ,并研究剂量与效应的关系。 [方法 ]用常规的细胞培养方法 ,利用RT PCR方法对 2种基因进行表达 ,并以 β actin作为内对照。对基因表达的强度进行比较分析。[结果 ]P3 8MAPK基因在 2种细胞中都有表达 ,在HepG2中 ,P3 8MAPK基因表达随浓度 1、5、10、2 0nmol/L增加先抑后扬 (表达值分别为 0 .90 0、0 .82 0、1.2 60、0 .898,P <0 0 5 ) ,而在SPC A1中差异无显著性 (表达值分别为 0 .898、 0 .919、 0 .80 8、 0 .846,P >0 0 5 )。P5 3基因在人体肝癌细胞株(HepG2 )中有表达 ,并随浓度增加而上调 (表达值分别为 0 .764、0 .890、1.0 99、1.2 18、1.40 5 ,P <0 .0 5 )而在肺腺癌细胞株(SPC A1)中未见表达。 [结论 ]二英对人体肝癌细胞株 (HepG2 )中P5 3基因和P3 8MAPK基因有诱导作用 ,在肺腺癌细胞株 (SPC A1)中仅见对P3 8MAPK基因有诱导作用 ,P5

马立克氏病病毒pp38基因真核表达质粒的构建及其在鸡胚成纤维细胞中的表达

通过 PCR方法扩增马立克氏病病毒 (Marek′s disease virus,MDV) Md11株的 pp38基因 ,并将其克隆到真核表达载体 pc DNA3.1/ zeo(+)中。阳性克隆鉴定后 ,在脂质体作用下转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,通过间接免疫荧光试验 (IFA)检测到了 pp38在 CEF中的表达。

p38MAPK基因诱导胶质瘤细胞凋亡

目的 研究 p38MAPK基因转染大鼠胶质瘤细胞系C6后对其生物学特性的影响 .方法 利用脂质体介导法将p38MAPK基因导入大鼠胶质瘤细胞系 C6中 ,用免疫细胞化学染色检测其在细胞转染前后的表达情况 ,用 HE染色、流式细胞仪等方法研究其对细胞形态、粘着状况和生长周期的影响 .结果 转染 p CMV5 - p38MAPK质粒组 p38MAPK蛋白表达阳性 ,细胞形态发生变化 ,贴壁性降低 ,出现大量凋亡细胞 .结论 转染

Hc38基因沉默对捻转血矛线虫L3期幼虫发育的影响

通过研究Hc38基因对捻转血矛线虫L3期幼虫发育的影响,探索Hc38基因功能,为利用该基因防治捻转血矛线虫的进一步研究提供依据。针对Hc38基因序列设计并合成特异性dsRNA和siRNA,采用浸泡的方法对捻转血矛线虫L3期幼虫进行RNA干扰(RNAi)试验,利用实时荧光定量PCR分析Hc38基因在L3期幼虫中的转录抑制效果,同时将dsRNA和siRNA浸泡24h后的L3期幼虫感染绵羊,研究Hc38基因的沉默对捻转血矛线虫L3期幼虫在绵羊体内发育的影响,定期采集绵羊粪便检查虫卵数,30d后剖检绵羊皱胃,检查荷虫数的变化。实时荧光定量PCR检测表明,各试验组Hc38基因的相对含量显著低于对照组(P<0.01),浸泡72h后,Hc38-dsRNA组和Hc38-siRNA组Hc38基因的表达量分别仅为对照组的32.27%和14.93%。绵羊体内干扰沉默效果显示,试验组Hc38干扰组虫卵减少率最高,为50%,减虫率最高,为48.6%。通过浸泡法导入的dsRNA和siRNA均能有效抑制Hc38基因的转录,同时Hc38基因的沉默与幼虫的发育密切相关,为捻转血矛线虫及其他寄生线虫的基因功能研究提供一种新的方法。

小麦抗叶锈近等基因系TcLr38的SRAP-SSR(eSSR)分析

小麦抗叶锈基因Lr38在我国高抗叶锈病,直到目前该基因的分子标记开发较少,开发其分子标记对于该基因的研究与利用具有重要意义。利用594对SRAP-SSR(eSSR)引物组合对以Thatcher为背景小麦抗叶锈近等基因系材料TcLr38和Thatcher进行PCR扩增。引物组合ARBI8-Xcwem8R和ARBI2-Xgwm497F在TcLr38中分别扩增出300和400bp多态性条带。利用47个小麦抗叶锈近等基因系进一步检测,引物ARBI8-Xcwem8R仅在TcLr38中扩增出特异条带。经TcLr38×Thatcher F2代分离群体验证,该标记与Lr38遗传距离较远。对该片段克隆测序,片段长度为277bp,BLAST比对与GenBank中所收录序列无相似性,该片段为与Lr38相关的新的序列。

捻转血矛线虫Hc38基因的克隆及其RNAi载体的构建

根据RNAi目标序列的选取原则和捻转血矛线虫Hc38基因(登录号AY749124)产物的保守结构域所在核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法从绵羊捻转血矛线虫雌性成虫中扩增出约400 bp cDNA序列,与AY749124序列同源性为99%。将目的序列亚克隆到RNAi载体L4440中,经PCR和酶切鉴定证明,成功构建了捻转血矛线虫对应于Hc38基因的RNAi载体L4440-Hc38。