天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究

目的 研究利用昆虫杆状病毒载体系统在昆虫培养细胞和虫体中高效表达新型多肽抗生素天蚕抗菌肽AD(cecropinAD ,CAD)。方法 采用聚合酶链反应 ( polymerasechainreaction ,PCR)点突变技术改造CAD基因 ,改造后的CAD基因先克隆到质粒 pGEM Teasyvector中进行鉴定和序列分析 ,然后再亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus ,AcNPV)表达载体pAcGP67B中 ,获得重组病毒载体 pAcAD。用重组病毒载体 pAcAD和野生AcNPVDNA共感染草地夜蛾 (Spodopterafrugiperdoda)Sf9细胞 ,经空斑法筛选得到重组病毒AcNPVAD。重组病毒AcNPVAD经PCR扩增鉴定 ,证实了CAD基因已经整合到重组病毒AcNPVAD中。结果 以AcNPVAD转染Sf9细胞和苜蓿丫纹夜蛾幼虫 ,抑菌活性试验证实CAD基因在昆虫培养细胞Sf9和苜蓿丫纹夜蛾幼虫虫体中均得到表达 ,表达产物具有抑菌作用。通过离子交换层析 ,杂蛋白基本去除 ,重组抗菌肽获得初步纯化 ,重组抗菌肽活性峰位于 0 75mol/L处。结论 CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达 ,表达产物具有抑菌活性。

AcNPV对棉铃虫的感染试验

棉铃虫穿刺接种病毒滴度为1×108,1×107,1×106,1×105,1×104,1×103,1×102pfu的AcNPV液,在幼虫期或蛹期都能感染发病,且随着AcNPV病毒浓度的增加死亡率也提高;镜检死亡幼虫或死亡蛹都可见AcNPV病毒多角体。设计AcNPV特异引物,对试验区存活的棉铃虫成虫进行PCR检测,收集阳性个体的后代幼虫,饲养后进行PCR检测AcNPV,结果均为阴性,初步试验表明,AcNPV病毒能感染棉铃虫幼虫、蛹及成虫,但并不能垂直传播。