Accutase酶在精原干细胞原代分离中的应用

背景:有研究报道胰酶消化在一定程度上会破坏精原干细胞表面抗原并影响细胞活性,对后续的细胞分选及下游实验有一定影响。Accutae酶具有蛋白酶和胶原酶的双重活性,在消化结束时无需终止和清洗,有保护细胞表面抗原的特殊作用,因而被应用于多种干细胞的培养及消化传代中。目的:比较Accutase酶和胰酶在原代消化分离睾丸组织获取精原干细胞中的作用。方法:新生5-7 d昆明雄鼠45只,取双侧睾丸胶原酶初步消化,混悬液定容后分为Accutase酶组、胰酶组、混合酶组(透明质酸酶+胰酶组),不同组别小鼠睾丸组织分别于酶消化1,3,5 min后显微镜下观察并拍照,比较各组不同时间点的消化状态及形成单细胞所需的时间;获取单细胞悬液后分别计算单位体积内所得细胞总数及死亡率;通过差速贴壁方法去除间质细胞及支持细胞,经包被有干细胞标志分子CD90.2的免疫磁珠进行分选,将所得CD90+及CD90-细胞用精原干细胞表面标志分子——胶质细胞源性神经营养因子受体α1标记,流式细胞仪检测不同组别CD90+及CD90-细胞群中胶质细胞源性神经营养因子受体α1精原干细胞的阳性率。结果与结论:不同类别的消化酶对小鼠睾丸的消化作用有明显差异,其中Accutase酶能更快获取单细胞悬液,其细胞团及破膜细胞明显少于胰酶组和混合酶组,其所得细胞总数高于其余2组,而细胞死亡率则低于其余2组。差速贴壁后细胞免疫磁珠分选结果显示Accutase酶组CD90+精原干细胞得率高,流式分选结果显示胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90+细胞为72.24%,高于胰酶组及混合酶组(51.16%,71.27%);而胶质细胞源性神经营养因子受体α1+/CD90-细胞比率(15.03%)则低于胰酶组及混合酶组(18.8%,24.23%)。结果表明Accutase酶在分离和获取精原干细胞实验中效果优于胰酶。

采用Accutase酶分离适合膜片钳记录的人诱导多能干细胞来源心肌细胞及其电生理学特性分析

目的 采用Accutase酶分离适合膜片钳记录的人诱导多能干细胞来源心肌细胞,并对其电生理学特性进行分析。方法 将人诱导多能干细胞在体外分化为心肌细胞。选择培养28~32天活性良好的心肌细胞,免疫细胞化学检测心肌细胞肌钙蛋白(cTNT)和肌动蛋白(α-actin)表达,膜片钳全细胞技术记录人诱导多能干细胞来源心肌细胞的动作电位。记录动作电位前采用Accutase酶将人诱导多能干细胞来源心肌细胞消化成单个心肌细胞,依据消化时间不同随机分为A、B、C、D、E组,各组消化时间依次为0.5、1、2、5及10 min,每组分别记录5~6个来自不同培养皿的细胞自发动作电位。对自发动作电位的频率、静息电位、阈电位、振幅、最大去极化速率、复极时间、超极化电位和最大自动除极速率进行分析。结果 免疫荧光显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞高表达心肌特异性标志物cTnT和α-actin;细胞消化前,肉眼下可见人诱导多能干细胞来源心肌细胞有自发跳动;各组细胞全细胞记录模式建立前的巨阻封接形成时间随着消化时间延长逐渐缩短[(4.80±1.10) min、(2.10±0.55) min、(2.20±0.84) min、(2.30±0.45) min、(0.75±0.27) min,P<0.01]。各组间建立全细胞记录模式的细胞膜电容和串联电阻无差异。消化后膜片钳全细胞模式记录显示人诱导多能干细胞来源心肌细胞有自发动作电位,并有明显平台期,随着消化时间延长,平台期逐渐缩短[各组90%复极时间依次为:(0.77±0.02) s、(0.78±0.06) s、(0.65±0.03) s、(0.45±0.01) s、(0.35±0.03) s,P<0.01]。结论 采用Accutase酶对人诱导多能干细胞来源心肌细胞进行分离有助于膜片钳记录。相比其他消化时间,Accutase酶消化1 min记录人诱导多能干细胞来源心肌细胞动作电位相对省时,同时可获得最佳动作电位形态。