第一代无细胞百日咳疫苗毒性国家参考品制备工艺的研究

目的筛选无细胞百日咳疫苗毒性国家参考品的最佳生产工艺。方法选用百日咳CS菌株(编号58003),对不同的培养方式进行比较研究,选择最佳毒性国家参考品的生产工艺。结果该参考品经过不同培养方式比较后,确定了最终生产工艺,将培养的百日咳菌加入保护剂后分装制备成冻干品。结论该生产工艺制备的样品含有较强的毒性,同时能进行规模生产,满足了毒性国家参考品各项检测指标的要求。

无细胞百日咳菌苗毒性试验参考苗制备条件的探讨

将不同灭活条件下制备的无细胞百日咳毒性试验参考苗进行了检测。结果表明，以浓度０．１％Ｆｏｒｍａｌｉｎ溶液２５℃灭活９６－１２０小时制备的无细胞百日咳菌苗毒性试验参考苗，凝集效价仍可达到百日咳Ⅰ相血清原效价；不耐热毒素试验呈阴性；毒性试验ＢＷＤＵ／ｍｌ为７５．９－１２８．４；ＬＰＵ／ｍｌ为２．１－６．０；ＨＳＵ／ｍｌ为３．９－５．７；稳定性良好。

无细胞百日咳疫苗效力国家参考品的建立

采用罐培养百日咳CS菌株，培养物经硫酸铵两段盐析、浸提后，再经蔗糖密度梯度离心，收集以FHA．PT为主的百日咳菌保护性抗原，经福尔马林解毒，制备成原液。该原液按照中国和日本的生物制品规程检定合格后，加入保护剂，稀释至18μgPN／ml，分装冻干制备成无细胞百日咳疫苗效力参考品。以JNIH3和JNIH－6参考品为标准，按照日本规程的小鼠脑腔攻击法标定其效力单位。根据14次效力试验所得的结果和日本NIH标定的结果，该批疫苗效力国家参考品的效力单位定为15PIU／ml。

无细胞百日咳工艺中(PO_4)^(3-)影响DTaP免疫效力分析

用 0 0 2mol/L磷酸盐缓冲液和不用磷酸盐缓冲液透析生产无细胞百日咳 (aP) ,按《2 0 0 0年版生物制品规程》制备和检定氢氧化铝吸附无细胞百日咳、白喉、破伤风联合疫苗 (DTaP)。发现用磷酸盐缓冲液和不用磷酸盐缓冲液透析生产aP组成DTaP免疫效力差异非常显著 ,后者 10 0 % (10 / 10 )合格 ,前者合格率只有 2 7% (3/ 11) ,用钼兰法测定DTaP中PO4 3 -离子浓度。结果表明后者的PO4 3 -浓度只是前者的 1/ 10。PO4 3 -依次影响白喉、破伤风。

吸附精制百日咳菌苗质量控制的研究

本文就吸附精制百日咳菌苗制检过程中使用的菌株、有效组分ＬＰＦ和ＦＨＡ提纯工艺以及毒性，效力等检定方法阳相应的质量控制指标等进行了研究。结果表明，中国Ｃ、Ｓ菌株产毒优于日本Ｔｏｈａｍａ株。ＬＰＦ和ＦＨＡ─ＥＬＩＳＡ用作菌苗工艺各步骤中质控有效组分的产量，是一种快速、敏感和特异的方法。根据５年中菌苗批量生产每ｍｌ培养基ＬＰＦ和ＦＨＡ产量逐年上升趋势，说明生产工艺不断改进完善和操作技术的熟练是提高菌苗产量和质量的关键。制检规程中用作毒性和效力试验的方法，是菌苗安全有效质控的有效实用方法。

吸附精制百日咳菌苗稳定性的研究

本文对新一代吸附精制百日咳菌苗保存于不同温度条件下的安全和效力稳定性进行了实验，结果表明，９批吸附精制百日咳菌苗经贮存于４～８℃条件下半年、１年、２年和３年后，贮存于常温（１８～２２℃）半年后和贮放于３７℃４０天后，其贮存前后的ＢＷＤＵ／ｍｌ、ＬＰＵ／ｍｌ和ＨＳＵ／ｍｌ间的数值变化，均在制检规程要求的标准数值内，无显著性差异（Ｐ＞０．０５），说明菌苗的毒性无逆转、菌苗的安全性良好。３批吸附精制百日咳菌苗经贮存于４～８℃条件下７个月和２年后、其贮存前后的效力单位间的数值变化，均在制检规程要求的标准数值内，无显著性差异（Ｐ＞０．０５），说明菌苗的效力无下降，菌苗的质量稳定。

无细胞百日咳疫苗小鼠中和抗体法的建立及效力评价验证

目的建立一种元细胞百日咳疫苗的功能性抗体检测方法，为无细胞百日咳疫苗原液及成品的生产一致性评价和效力评价提供一种便捷有效的解决方案。方法优化并使用CHO细胞簇集试验方法检测鼠免疫血清的百日咳毒素中和抗体滴度。结果确定疫苗样品以1／5人用剂量腹腔免疫20～24g、5周龄的雌性NIH小鼠10只，4周后采血分离血清，倍比稀释血清用0．1IU／ml的百日咳毒素国家参考品中和2h，加入到预先培养的CHO细胞孔中孵育48h后判定簇集结果，最终不簇集孔的血清稀释倍数的几何均值即为样品中和抗体滴度。不同工艺无细胞百日咳疫苗的中和抗体滴度有显著性差异；不同工艺无细胞百日咳疫苗改良脑腔攻击试验结果通过与不通过的产品中和抗体有明显区分度。结论百日咳毒素中和抗体法大幅减少动物使用量，CHO细胞簇集试验具备一定的重复性和精密性，可以满足不同工艺无细胞百日咳疫苗成品及原液的生产一致性和效力的监测和初步评价。

无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法的建立及适用性的初步验证

目的建立无细胞百日咳疫苗血清学效价检测方法(PSPT),并对其适用性进行初步验证。方法采用纯化的百日咳毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)包被酶标板,以羊抗鼠IgG酶标抗体为指示抗体,建立检测小鼠抗PT抗体和抗FHA抗体的间接ELISA法,并对该方法进行初步验证。在此基础上建立PSPT法,并与MICA法进行相关性分析。结果建立了小鼠抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA,标准曲线线性范围内R≥0.99;经验证,两系统与无关抗体之间均无交叉反应;检测限度分别为93.7500和59.0625mEU/ml,检测限量分别为100和70mEU/ml。将10批无细胞百日咳原液分别以PSPT法和MICA法进行效价测定,两者呈正相关,两种方法检测结果差异无统计学意义,且PSPT法比MICA法重复性更好。结论抗PT抗体ELISA和抗FHA抗体ELISA灵敏度高,准确性及精密性均较好,在此基础上建立起来的PSPT法有望替代MICA法,用于检测无细胞百日咳疫苗的效价。