中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1 RNA最佳干扰片段的筛选

为了更好地筛选出中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1有效干扰序列,本研究以中华蜜蜂气味受体基因AcerOr1为靶标,分别选取3个片段AcerOr1-1(429 bp)、AcerOr1-2(218 bp)和AcerOr1-3(543 bp),并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后通过单只饲喂进行体内RNAi实验,运用qPCR和Western blot从mRNA水平和蛋白水平检测干扰效率。实验结果显示:片段大小429 bp组ds AcerOr1-1和对照组mRNA表达量之间不具有显著的统计学差异(P>0.05),片段大小为218 bp的ds AcerOr1-2组和片段大小为543 bp的ds AcerOr1-3组对AcerOr1表达量都有显著的抑制(P<0.05),抑制率分别为88.85%±0.12%和69.16%±1.06%,以片段大小为218 bp的ds AcerOr1-2干扰效果最佳。Western blot结果显示:与mRNA表达水平检测结果一致,饲喂ds AcerOr1-1 AcerOr1蛋白的表达量与对照组差异不显著(P>0.05),而饲喂ds AcerOr1-2和ds AcerOr1-3后AcerOr1蛋白的表达量均受到显著抑制(P<0.05)。本试验成功构建AcerOr1基因干扰载体,最终确定218 bp的ds AcerOr1-2为最佳干扰片段,证实其能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达,为进一步研究该基因的体内外功能奠定了基础。

中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子克隆及序列分析

为获取中华蜜蜂气味受体AcerOr1基因启动子并分析调控元件,以前期获得的中华蜜蜂AcerOr1基因的cDNA序列为模板,设计特异性引物并采用染色体步移的方法,从中华蜜蜂基因组中克隆到AcerOr1基因部分序列及其5'侧翼区,并分析其调控元件组成。生物信息学分析结果表明,克隆产物长1831 bp,3′侧翼序列与GenBank中AcerOr1基因序列的5'端序列同源性为92%;在1100~1139 bp处存在基础启动子,其序列为:5′-ATTATATAAATATTGCTCGTGGCAAAATGATTCATAAGT-3′,转录起始位点可能位于翻译起始密码子ATG上游621 bp处的碱基T,其可能性为0.98。除含有基本启动子元件(TATA-Box、CAAT-Box等)外,还存在与胚胎发育或组织发育相关的元件CF2-II、NIT2、CdxA和与环境应激相关的元件HSF,表明AcerOr1基因在中华蜜蜂体内的转录和表达可能受到胚胎、组织及外界环境的调控。

中华蜜蜂AcerOr1基因昆虫表达载体pIB/V5-His的构建及功能分析

【目的】构建能在Sf9昆虫细胞中稳定高效表达中华蜜蜂气味受体AcerOr1的重组表达载体,并对其功能进行分析。【方法】将目的基因AcerOr1和昆虫表达载体pIB/V5-His载体用Bam HI和EcoRI做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含目的基因AcerOr1的表达载体pIB/V5-AcerOr1。将重组表达载体用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞中,利用免疫荧光和Western blot检测AcerOr1蛋白的亚细胞定位和表达情况;利用全波长多功能酶标仪检测该受体对4种花香物质刺激后细胞内Ca2+浓度的变化。【结果】成功构建重组表达载体pIB/V5-AcerOr1并建立稳定转染细胞系;Western blot结果证明重组表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达;免疫荧光显示重组表达载体在Sf9细胞膜上表达,与预测结果一致。转染pIB/V5-AcerOr1的细胞受花香物质月桂酸(Lauric acid)、亚麻酸(Linolenic acid)、α-松油醇(α-Terpineol)、十一酸(Undecanoic acid)刺激时,均能引起细胞内Ca2+浓度升高。【结论】构建的重组表达载体pIB/V5-AcerOr1能在Sf9细胞中稳定表达,并具有对气味分子的识别功能。