中华蜜蜂气味受体AcerOr2的体外表达特性研究

本研究旨在对中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体基因AcerOr2体外表达特性进行分析验证。本研究利用qRT-PCR和Western blotting检测体外RNA干扰(RNAi)的效果,并通过钙离子成像检测该受体在RNAi前后对气味配体的结合特性。结果显示:体外AcerOr2的最佳干扰浓度为5μg的dsAcerOr2,其能有效抑制目的基因在Sf9细胞中mRNA和蛋白的表达,且AcerOr2本身缺乏对植物气味物质的敏感性,只对其激动剂VUAA1敏感,RNAi后其对VUAA1敏感也有所降低。AcerOr2体外表达特性的验证,可以为进一步研究AcerOr2在嗅觉过程中的功能机制提供基础。

中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因最佳干扰片段的筛选

为了筛选出中华蜜蜂气味受体基因AcerOr2最佳干扰效率的序列,以中华蜜蜂气味受体AcerOr2基因为靶标,分别选取3个片段AcerOr2-1(411 bp)、AcerOr2-2(205 bp)和AcerOr2-3(471 bp),并构建相应的dsRNA表达载体,获取dsRNA后进行RNAi试验,通过qPCR和Western从mRNA水平和蛋白水平检测干扰效率。mRNA结果显示,饲喂3个不同的片段AcerOr2-1(411 bp)、AcerOr2-2(205 bp)和AcerOr2-3(471 bp)对AcerOr2表达量均会产生抑制作用,抑制率分别为69.72%±0.49%、47.26%±0.25%、73.17%±0.97%,抑制率最佳的是471 bp的dsRNA AcerOr2-3。Western Blot结果显示,饲喂3个大小不同的干扰片段后AcerOr2蛋白的表达量均受到显著抑制。试验成功构建AcerOr2基因干扰载体,最终确定471 bp的dsRNA AcerOr2-3为最佳干扰片段,证实其能有效抑制目的基因mRNA和蛋白的表达。研究结果可为进一步应用RNAi技术研究该基因的体内外功能奠定基础。

中华蜜蜂AcerOr2基因昆虫表达载体pIB/V5-His的构建

为构建能稳定高效表达中华蜜蜂气味受体AcerOr2的重组表达载体,并在Sf9昆虫细胞中表达,将目的基因AcerOr2和昆虫表达载体pIB/V5-His用BamHⅠ和EcoRⅠ做双酶切,通过T4 DNA连接酶构建成含目的基因AcerOr2的表达载体pIB/V5-His-AcerOr2。将重组DNA用脂质体转染的方法转染至Sf9细胞中,利用Western blot和免疫荧光检测AcerOr2蛋白的表达和亚细胞定位情况。结果表明,成功构建重组表达载体pIB/V5-His-AcerOr2并建立稳定转染细胞系;Western blot结果证明,重组表达载体能在昆虫细胞Sf9中表达,融合蛋白相对分子质量为56 ku左右;免疫荧光显示,重组表达载体在Sf9细胞膜上表达,与预测结果一致。说明构建的重组表达载体pIB/V5-His-AcerOr2能在Sf9细胞中稳定表达,为进一步研究中华蜜蜂气味受体AcerOr2的功能奠定了基础。