新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A对心肌细胞肥大的影响及机制研究

目的探讨酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A(Anp32a)对心肌细胞肥大的作用及机制。方法通过挖掘数据库小鼠心脏假手术组及主动脉缩窄手术组芯片数据,进行差异基因分析。选取8~10周龄小鼠,随机分为模型组和假手术组(n=7或8),终末取材提取心脏组织RNA检测Anp32amRNA表达水平。构建Anp32a敲低(AdshAnp32a),Anp32a过表达(AdAnp32a)及其相应的对照组AdshRNA,AdGFP腺病毒并转染H9C2心肌细胞,以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激H9C2心肌细胞诱导心肌细胞肥大,提取细胞RNA通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测心肌肥厚指标[心房利钠肽(AnP),脑利钠肽(Bnp),β-肌球蛋白重链(β-Mhc)]表达变化,并通过心肌细胞骨架蛋白(α-actinin)的免疫荧光染色观察Anp32a对心肌细胞大小的影响。机制研究方面,通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测Anp32a在调节心肌肥厚过程中涉及的信号通路的变化。结果 Anp32a在心肌肥厚模型中表达下调。AngⅡ刺激细胞,免疫荧光染色检测AdAnp32a组细胞明显较其对照组(AdGFP)减小,而AdshAnp32a组心肌细胞与其对照组(AdshRNA)相比显著增大。qPCR检测显示AdAnp32a组心肌肥厚基因(Anp、Bnp、β-Mhc)的mRNA表达降低,而AdshAnp32a组表达则相反。Western blot检测发现Anp32a能够抑制AngII诱导的Akt蛋白磷酸化水平的升高。结论 Anp32a通过AKT信号通路抑制心肌细胞肥大,可作为防治心肌肥厚及心力衰竭的潜在治疗靶点。