基于网络毒理学与分子对接技术初步探究准噶尔乌头炮制减毒的作用机制

目的采用网络毒理学与分子对接技术初步探究准噶尔乌头炮制减毒的作用机制。方法通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)、毒理学数据库(TOXNET)、反向药效团匹配数据库(Pharmmapper)和文献筛选准噶尔乌头的毒性成分和潜在靶点,乌头碱和准噶尔乌头碱为准噶尔乌头炮制前的主要成分,经炮制后乌头碱主要水解生成苯甲酰乌头原碱,准噶尔乌头碱结构稳定,未发生变化。比较毒理基因组学数据库(CTD)、疾病靶点筛选数据库(TTD)、疾病基因数据库(DisGeNET)、基因名片数据库(GeneCards)挖掘心脏毒性靶点。通过韦恩平台(Venny)获取准噶尔乌头心脏毒性的关键靶点,再从关键靶点中获取乌头碱、准噶尔乌头碱和苯甲酰乌头原碱的交集靶点。采用R软件对关键基因功能注释分析,运用Cytocape 3.7.2绘制准噶尔乌头-作用靶点关系网络图。辅以分子对接技术和心肌细胞H9c2对炮制前后主成分-准噶尔乌头碱、乌头碱和苯甲酰乌头原碱的心脏毒性进行验证。结果共得到准噶尔乌头毒性成分18个,关键靶点22个。草乌甲素、3-脱氧乌头碱、准噶尔乌头碱、乌头碱为准噶尔乌头的主要毒性成分,通过作用于丝裂原激活蛋白激酶1(MAPK1)、丝裂原激活蛋白激酶14(MAPK14)、血清白蛋白(ALB)等靶点,介导有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、白细胞介素17(IL-17)信号通路、叉头框蛋白O(FoxO)信号通路等途径,诱发心脏毒性作用。分子对接验证了准噶尔乌头的主要毒性成分草乌甲素、乌拉尔宁、准噶尔乌头碱等,与ALB、MAPK1、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)等靶点的结合潜能较好。心肌细胞实验结果显示乌头碱、准噶尔乌头碱和苯甲酰乌头原碱的IC_(50)分别为0.357、0.617、1.070 mg/mL,乳酸脱氢酶(LDH)释放量和细胞凋亡率均随药物浓度增加而升高(乌头碱>准噶尔乌头碱>苯甲酰乌头原碱),乌头碱的心脏毒性最大,大约是其水解产物苯甲酰乌头原碱的3倍。结论准噶尔乌头炮制品通过多成分多靶点多通路介导心脏毒性发生。准噶尔乌头经炮制后心脏毒性降低,减毒机制可能与调控纤溶酶原(PLG)靶点有关。

药用植物准噶尔乌头的研究

对准噶尔乌头的生物学特性，有效成分的鉴别、分高等方面进行了研究报道；从准噶尔乌头中首次分得12－表－欧马碱及12－表－脱氢欧乌碱，且准噶尔乌头碱、新乌碱含量较高，为准噶尔乌头药用资源的开发利用提供了依据。

新疆准噶尔乌头及其炮制品的急性毒性和镇痛作用实验研究

目的研究新疆准噶尔乌头生品及其炮制品的急性毒性和镇痛作用。方法对小鼠腹腔注射不同浓度的准噶尔乌头生品和3种炮制品水煎液,采用改进寇氏法获得准噶尔乌头及其炮制品对小鼠的半数致死量(LD50)。采用辐射热刺激法和醋酸致小鼠扭体实验,考察准噶尔乌头及其炮制品高、中、低不同剂量的镇痛活性。结果 (1)新疆准噶尔乌头生品及其炮制品毒性:生品>文献法>药典法>哈族法,新疆准噶尔乌头生品、药典法、文献法、哈族法炮制品的LD50分别为3.079 2、26.219 1、10.587 3、39.870 2g/kg。(2)与对照组相比,药典法、哈族法炮制品的低剂量组痛阈值无明显差异(P>0.05),镇痛效果弱;其余给药组的痛阈值增大(P<0.05～0.01),具有镇痛效果,能明显延长由小鼠辐射热刺激所引起的小鼠甩尾潜伏期。与盐酸曲马多组比较,准噶尔乌头生品及其各炮制品的高剂量组差异无统计学意义。(3)与对照组相比,盐酸曲马多组、生品、药典法炮制品、文献法炮制品的高剂量组与中剂量组以及哈族法炮制品的高剂量组均可以减少小鼠扭体次数(P<0.05～0.01),具有一定的镇痛作用。结论新疆准噶尔乌头生品及其炮制品具有一定的毒性,应引起临床用药的注意;同时,新疆准噶尔乌头生品及其炮制品具有不同程度的镇痛作用。

准噶尔乌头及其炮制品对AA大鼠治疗作用的实验研究

目的:观察准噶尔乌头及其炮制品对佐剂性关节炎(AA)大鼠的作用,并探讨其作用机制。方法:设正常对照组、模型对照组、阳性药对照组(醋酸泼尼松片6 mg/kg)、准噶尔乌头及其炮制品(包括按药典方法、文献方法、哈萨克族方法 3种炮制品)高、中、低剂量组(剂量分别为30.65,15.32,7.66 mg/kg);除正常对照组外,其余各组均采用弗氏完全佐剂(FCA)诱导大鼠AA模型;各组于造模致炎当天灌胃给药,连续23 d;观察各药对AA大鼠踝关节足肿胀程度和关节炎指数的影响;采用ELISA法检测各组血清中白介素-1β(IL-1β)和皮质醇(Cort)含量。结果:(1)模型组大鼠踝关节足肿胀度高于正常组(P<0.01),与模型组比较,准噶尔乌头及其炮制品各给药组踝关节足肿胀度和关节炎指数均显著降低(P<0.01或P<0.05)。(2)与正常组比较,模型组大鼠血清IL-1β、Cort水平均高于正常组(P<0.01);与模型组比较,阳性组、准噶尔乌头生品高、中、低剂量组及药典法炮制品高、中剂量组和文献法炮制品高剂量组的大鼠血清Cort水平均降低(P<0.01);与模型组比较,阳性组、准噶尔乌头生品和药典法炮制品高、中、低剂量组及文献法炮制品高剂量组、哈萨克族法炮制品中剂量组的IL-1β水平均降低(P<0.01或P<0.05)。结论:准噶尔乌头及其炮制品具有抗炎作用,其机制可能是通过抑制炎症细胞因子IL-1β、Cort治疗佐剂性关节炎大鼠。

准噶尔乌头中4种生物碱在炮制过程中的含量变化

目的通过HPLC法测定准噶尔乌头Aconitum soongaricum Stapf.中4种生物碱的含有量,并研究其随炮制时间的变化。方法准噶尔乌头乙醚提取液的分析采用XBridge TM C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;以甲醇-水-氯仿-三乙胺（67∶33∶2∶0.1）为流动相,等度洗脱;体积流量0.8 m L/min;检测波长235 nm;柱温40℃。加热水煮法炮制该药材,比较各生物碱含有量随炮制时间（0~255 min）的变化。结果准噶尔乌头碱、12-表-欧乌头碱、乌头碱、脱氧乌头碱平均含有量分别为1.111 3、1.980 2、6.562 6、0.270 9 mg/g。随着炮制时间增加,乌头碱相对峰高变化最显著,脱氧乌头碱逐渐消失,准噶尔乌头碱以和12-表-欧乌头碱较稳定。在18 min和25 min出现了新色谱峰,无明显变化规律。结论准噶尔乌头中上述4种生物碱经过加热水煮炮制后均发生了水解,可达到减毒效果。

HPLC和TLC法测定准噶尔乌头中的生物碱成分

采用高效液相色谱和薄层色谱对准噶尔乌头中生物碱进行分析,建立了HPLC法测定其中各生物碱含量的方法。结果确定准噶尔乌头中主要含有12-表-欧乌碱、宋果灵、尼奥灵、准噶尔碱和欧乌碱,其中准噶尔碱和欧乌碱为首次在该植物中发现;其疗效与川乌和草乌相近但化学成分差异较大。色谱条件为:Inertsil NH2柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相正己烷∶乙醇(92∶8),流速1.0 mL/min,检测波长270 nm,进样量10μL。本方法操作简便,结果可靠,重现性好,为准噶尔乌头的质量标准研究提供了实验依据。

准噶尔乌头中一株农作物致病菌拮抗菌的分离及鉴定

目的:从准噶尔乌头(Aconitum soongaricum Stapf)中分离具有抗农作物致病菌的内生菌,并对其进行系统鉴定。方法:采用研磨法从准噶尔乌头的根和叶等组织中分离内生菌;再通过琼脂扩散法筛选具有抗农作物致病菌活性的内生菌;利用传统的形态学观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析对拮抗菌进行鉴定,并对其代谢产物做了生物碱和多糖的检测。结果:从准噶尔乌头中分离到菌株XJAS-ZB-36具有较好拮抗作用,分别对玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、苹果斑点落叶病菌西瓜枯萎病、葡萄白腐病具有拮抗作用,经形态学观察和分子分类学分析鉴定与枯草芽孢杆菌(Bcillus subtilis)指标一致,与Bacillus subtilissub sp.subtilis NBRC137197(AB271744)处在同一分支,相似性为100%,G+Cmol%为33.4%。该菌株代谢产物中含有生物碱和胞外多糖。结论:从准噶尔乌头中分离到的内生细菌XJAS-ZB-36,可作为生物农药生产的候选菌株。

准噶尔乌头中一株苹果斑点落叶病菌拮抗菌的分离及鉴定

从准噶尔乌头(Aconitum soongaricum Stapf)的根茎中分离出1株对苹果斑点落叶病菌(Alternaria mali)有拮抗作用的内生菌XJAS-ZB-14,其主要生理生化指标与短小芽孢杆菌相符。利用16SrDNA通用引物对其基因组DNA进行扩增,并测序得到XJAS-ZB-14的部分16SrDNA序列,GenBank注册号为FJ237280。经Blastn比对,用软件MEGA4.0按照Neighbor-Joining方法构建16SrDNA系统发育树。与菌株XJAS-ZB-14同源性最高的菌株为Bacillus pumilus DSM27T(AY456263),相似性为100%,(G+C)mol%为53.41%,最终鉴定为短小芽孢杆菌Bacilluspumilus,并对其生长条件作了研究。

基于特征图谱及主要成分含量比例特征鉴别制草乌及其伪品

基于特征图谱并根据主要成分含量比例特征,建立一种鉴别制草乌及其伪品的方法。采用Waters XBridge C_(18)(250 mm×4.6 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-四氢呋喃(体积比为25∶15)和0.1 mol/L乙酸铵水溶液为流动相,检测波长为235 nm,流量为1.0 mL/min,柱温为30℃,用高效液相色谱进行测定生物碱;采用ChemPattern化学计量学软件对采集的数据进行处理分析。制草乌和伪品中3种成分的含量比例显著不同,制草乌中苯甲酰新乌头原碱为含量最高的成分,伪品中苯甲酰乌头原碱含量最高。苯甲酰新乌头原碱与苯甲酰乌头原碱含量比值在正、伪品中差异大,正品约为10,伪品约为3/100;苯甲酰次乌头原碱与苯甲酰乌头原碱含量比值差异大,正品约为1,伪品约为3/100。该法建立的制草乌特征图谱专属性强,可结合3种主要成分含量的比例特征鉴别正、伪品,为规范制草乌药材的使用提供科学依据。

基于细胞膜色谱法的新疆准噶尔乌头中抗EGFR活性成分筛选

目的:从准噶尔乌头中筛选抗EGFR作用的活性成分,并考察筛选成分对HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的抑制活性。方法:用高表达表皮生长因子受体细胞膜色谱(EGFR/CMC)通过十通切换阀与高效液相色谱(HPLC)构成二维在线联用色谱系统,将CMC上保留的组分进行接液,用离线MS来鉴定准噶尔乌头中抗EGFR活性成分;利用分子模拟对接实验分析活性成分与受体的相互作用方式;体外用MTT实验证实活性组分对HEK293细胞和EGFR/HEK293高表达细胞株的抑制作用。结果:乌头碱、12-表-欧乌碱、准噶尔乌头碱为作用于EGFR的有效成分,并具有与对照药物吉非替尼类似的色谱保留特性;分子模拟对接实验表明这些成分与EGFR的相互作用方式与阳性药吉非替尼相似;MTT实验证实在浓度为0.4~50μmol·L^(-1)范围内乌头碱,12-表-欧乌碱,准噶尔乌头碱对HEK293细胞增殖与EGFR高表达的体外抑制作用具有剂量依赖性。结论:筛选的结果与生物效应相一致;在线EGFR/CMC-HPLC-MS二维色谱系统在中药复杂体系中快速筛选发现活性物和药物先导物方面具有良好的应用前景,同时充分展现了细胞膜色谱法操作简便,快速,高效灵敏的优势。

基于网络药理学的准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌作用机制研究

目的运用网络药理学探讨准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌的作用机制。方法根据准噶尔乌头与乌头属植物具有化学亲缘性的特点,利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、中药分子机制的生物信息学分析工具(BATMAN-TCM)等数据库并结合文献收集、筛选准噶尔乌头及其炮制品、乌头属植物有效活性成分。利用Swiss、GeneCards、基因表达数据库(GEO)等数据库预测药物和疾病的靶点。采用Draw Venn Diagram软件识别准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌关键靶点,在Cytoscape 3.6.1软件中构建"疾病-药物-成分-靶点"网络。利用String数据库和Cytoscape 3.6.1软件构建关键靶点蛋白互作网络图;利用DAVID和R软件对关键靶点进行富集分析。结果得到准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌的有效活性成分27个,关键靶点152个。准噶尔乌头碱、脱氧乌头碱、次乌头碱等可能是主要活性成分,其作用于PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3CG、表皮生长因子受体(EGFR)等靶点,参与癌症途径信号通路、PI3K-Akt信号通路、血管内皮生长因子(VEGF)信号通路、缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路等多条信号通路,发挥抗卵巢癌作用。结论准噶尔乌头炮制品抗卵巢癌具有多成分、多靶点、多通路的特点,为开发具有民族特色的抗卵巢癌新药提供了思路。

毛序准噶尔乌头化学成分的研究

目的研究毛序准噶尔乌头Aconitum soongaricum Stapf var.pubescens Steinb.的化学成分。方法毛序准噶尔乌头80%乙醇提取物的乙酸乙酯部位采用硅胶、反相、Sephadex LH-20、制备柱进行分离纯化,根据波谱数据鉴定所得化合物的结构。结果从中分离得到6个化合物,分别鉴定为山柰酚-7-O-α-L-鼠李糖苷(1)、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(2)、山柰酚-3-O-α-L-阿拉伯糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(3)、对羟基肉桂酸甲酯(4)、4-羟基苯基-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、(3S,5R,6R,7E,9S)-3,5,6,9-tetrahydroxy-7-en-megastigmane(6)。结论所有化合物均为首次从该植物中分离得到。

准噶尔乌头的生物碱成分及其对一氧化氮生成的抑制作用研究

目的:研究准噶尔乌头Aconitum soongaricum Stapf的生物碱成分及其对一氧化氮(NO)生成的抑制作用。方法:采用硅胶柱、MCI-gel及Sephadex LH-20凝胶柱层析等多种色谱分离方法,对准噶尔乌头的总生物碱部位进行分离纯化,根据^(1)H-NMR、^(13)C-NMR等波谱数据对所得化合物进行结构鉴定,并评价这些化合物对脂多糖(LPS)诱导的小鼠巨噬细胞NO生成的抑制作用。结果:从准噶尔乌头中共分离得到16个生物碱成分,分别鉴定为:宋果灵(1)、准噶尔乌头胺(2)、azitine(3)、新乌宁碱(4)、欧乌头碱(5)、12-表-脱氢欧乌碱(6)、14-O-乙酰尼奥林(7)、苯甲酰乌头宁(8)、15α-羟基尼奥林(9)、欧乌头碱氮-氧化物(10)、(+)-isoboldine(11)、(+)-glaucine(12)、(+)-N-methyllaurotetanine(13)、N-methyl hordenine(14)、hordenine(15)、N-acetyl hordenine(16)。检测化合物1~13在25μmol/L浓度下对小鼠巨噬细胞NO生成的抑制作用,化合物3的抑制率为(68.2±5.9)%,其余化合物的抑制率均低于3%。结论:其中,化合物3、8、11~16为首次从该植物中分离得到,化合物3具一定的抗炎活性。

准噶尔乌头与川乌、草乌的性状与显微鉴别

目的:准噶尔乌头与川乌,草乌均为毛茛科乌头属植物的块根,避免有混淆乱用的现象发生,分别对其根进行性状以及显微鉴别研究。方法:采用性状、组织横切面及粉末显微等鉴定方法对准噶尔乌头,川乌以及草乌的根进行了比较研究。结果:性状:(1)准噶尔乌头颜色较深,呈黑褐色,一般2～4枚水平成链;(2)准噶尔乌头一般呈倒卵形,川乌,草乌则呈不规则的圆锥形或类圆锥形。显微鉴别:(1)准噶尔乌头的具缘纹孔导管更为平直,长约500μm,网纹导管常见;(2)准噶尔乌头的淀粉粒一般呈半月形,多单粒,石细胞一般呈类方形;(3)准噶尔乌头以及草乌均有非腺毛,前者呈条叶形,较少;后者较多并且短而尖;(4)准噶尔乌头的纤维上偶见沙晶。结论:准噶尔乌头与川乌、草乌之间有较为显著的性状和显微特征区别,可以为川乌和草乌在临床使用过程中准确检出准噶尔乌头提供科学依据。

基于HPLC指纹图谱的准噶尔乌头化学亲缘关系研究

目的以HPLC指纹图谱为基础,对比分析准噶尔乌头同川乌和草乌,以及新疆常见的白喉乌头的色谱指纹图谱间的相似度,评价准噶尔乌头、白喉乌头与川乌、草乌的化学亲缘关系。方法通过Chem Pattern化学指纹图谱分析系统解决方案软件,将准噶尔乌头指纹图谱的共有模式分别同川乌、草乌、白喉乌头指纹图谱的共有模式进行聚类分析、相似度分析、主成分分析。结果化学指纹图谱分析系统解决方案软件分析表明,准噶尔乌头与草乌相似度较高,白喉乌头和川乌的相似度较高。结论初步确定新疆白喉乌头和已有法定标准的草乌相似度较高,值得进一步研究开发。

新疆准噶尔乌头中乌头碱及脱氧乌头碱水解机制研究

目的对准噶尔乌头中2种成分水溶液在不同加热条件下稳定性进行考察,通过液质联用方法测定其水解产物,分析其水解变化规律,并在准噶尔乌头药材中进行验证,分析准噶尔乌头炮制前后生物碱类成分的变化情况,总结其变化规律,揭示准噶尔乌头炮制水解机制,为准噶尔乌头炮制工艺参数的确定提供理论依据。方法采用单一成分水溶液在不同加热条件下稳定性研究方法,以准噶尔乌头中2种主要化学成分乌头碱和脱氧乌头碱为研究对象,结合HPLC和HPLC-MS测定结果,总结各生物碱单体的变化规律,并在准噶尔乌头不同时间的炮制品中进行验证。结果经过不同加热时间后,乌头碱及脱氧乌头碱的变化最为明显,乌头碱水溶液经过不同加热时间后主要生成一些水解产物,随着加热时间的增加,乌头碱逐渐减少,直至检测不到。结论初步确定准噶尔乌头的炮制工艺参数为加热5～6 h,乌头碱及脱氧乌头碱发生水解产生了新的水解产物,从而达到减毒增效的效果。

新疆准噶尔乌头高效液相色谱指纹图谱的建立

目的:建立准噶尔乌头HPLC指纹图谱,为新疆准噶尔乌头质量控制提供方法学依据。方法:以正交试验方法多指标优化准噶尔乌头HPLC指纹图谱供试品前处理方法,建立准噶尔乌头HPLC指纹图谱,并对其主要色谱峰进行归属性鉴别。结果:建立的指纹图谱分离度好,稳定性高,得到准噶尔乌头4个特征峰,分别是苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、乌头碱和未命名化合物1。结论:建立的准噶尔乌头HPLC指纹图谱供试品前处理方法和色谱条件可行、全面,为新疆准噶尔乌头质量控制奠定基础。

民族药准噶尔乌头不同提取部位化学成分的差异性分析

目的建立HPLC同时测定各生物碱含量的方法,并对准噶尔乌头的乙酸乙酯和乙醇提取部位进行分析。方法采用Agilent TC-C_(18)(2)色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相为0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),二元梯度洗脱(0~12 min,10%→16%B;12~30 min,16%→35%B;30~40 min,35%→45%B;40~45 min,45%B),流速1.0 mL·min^(-1),检测波长235 nm,柱温35℃,进样量20μL。结果在45 min内生物碱成分均能完全分离,峰面积与进样量呈良好线性关系。乙酸乙酯提取物中含有次乌头原碱、高乌甲素、苯甲酰乌头原碱与乌头碱等,而乙醇提取物中含有宋果灵、苯甲酰乌头原碱、乌头碱、草乌甲素与3-脱氧乌头碱等,含量分别在1~130 mg·g^(-1)之间,2个提取部位所含生物碱的种类与含量均有较大差异。结论该方法操作简便,结果可靠,重复性好,可用于准噶尔乌头药材的质量控制,并为其他乌头类药材中生物碱的定量分析提供参考。

准噶尔乌头对模式大鼠生化指标的影响及其模式识别分析

目的:探讨准噶尔乌头对生物体各器官可能造成的毒性及相应生化指标的变化规律,并比较药材不同提取部位之间毒性的异同。方法:分别对准噶尔乌头乙酸乙酯提取部位与乙醇部位进行全自动生化分析,采用SPSS 13.0统计软件分析各项生化指标的变化规律;再利用SIMCA14.0软件对生化指标开展多元变量分析,及PCA、PLS-DA和OPLS-DA模式识别,阐明生化指标随时间的区分度和差异性,及不同提取部位的标志性生化指标。结果:该药材对肝与肾的毒性较大,标志性生化指标均为LDH与AST,其中乙醇部位引起所有指标在2h内的变化与振荡更加剧烈,且在6h^12h之间又出现反复波动,对生物体的影响更加明显。结论:在临床上使用该类药材时应该重视对肝、肾的保护措施,或者是对肝与肾的恢复治疗;且当此类药材中毒时尽可能在2h内采取急救措施。

准噶尔乌头中生物碱类成分的研究

目的研究毛茛科乌头属植物准噶尔乌头Aconitum soongaricum Stapf根部中的生物碱类化学成分。方法采用硅胶柱色谱法进行分离纯化,采用1HNMR、13CNMR鉴定结构。结果从新疆产的准噶尔乌头的干燥块根中共分离纯化得到10个单体化合物,分别鉴定为:乌头碱(Ⅰ)、3-去氧乌头碱(Ⅱ)、尼奥灵(Ⅲ)、宋果灵(Ⅳ)、苯甲酰乌头原碱(Ⅴ)、8-亚油酰基-苯甲酰乌头原碱(Ⅵ)、8-柠檬酸-苯甲酰乌头原碱(Ⅶ)、14-乙酰基尼奥灵(Ⅷ)、光翠雀碱(Ⅸ)、中乌碱(Ⅹ)。结论化合物Ⅵ~Ⅹ为首次从该植物中分离得到。