重组结核杆菌热休克蛋白Acr2的原核表达、纯化及鉴定的研究

目的原核表达、纯化结核杆菌热休克蛋白Acr2分子,并分析其免疫反应性。方法采用PCR法扩增结核杆菌Acr2基因,并构建重组表达质粒PET22b-Acr2,转化大肠埃希菌BL21(DE3)菌株,并用IPTG诱导Acr2蛋白表达。以及使用镍离子亲和层析柱纯化该表达产物,并通过Western blot检测其免疫反应性。结果 PCR、双酶切和测序结果均表明PET22b-Acr2重组质粒构建成功,其在大肠埃希菌中主要以包涵体蛋白形式进行表达。复性后的包涵体蛋白经镍离子亲和层析柱纯化后,可获得纯化的Acr2重组蛋白,该重组蛋白分子质量约为18.3ku,与结核分枝杆菌Acr2蛋白的理论预测值相符。经Western blot检测显示该重组蛋白能被结核病人血清特异性识别。结论原核表达质粒PET22b-Acr2被成功构建,以及Acr2重组蛋白被有效进行表达和纯化,从而为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

结核分枝杆菌分子伴侣Acr2蛋白的原核表达及其功能分析

目的 在E.coli中表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分子伴侣Acr2蛋白,并分析其功能。方法 将重组质粒pET-28a-Acr2转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达His-Acr2蛋白,经Ni-NTA层析及SuperdexTM200 10/300 GL凝胶过滤层析纯化获得Acr2蛋白。将Acr2蛋白经热变性(100℃温浴15 min)及化学变性(8 mol/L尿素,37℃温浴4 h)后进行自发再折叠和再组装的复性处理,采用圆二色性光谱法和非变性SDS-PAGE检测变性及复性后Acr2蛋白的二级结构。通过底物结合试验检测Acr2蛋白在体外的分子伴侣功能。结果 纯化Acr2蛋白的相对分子质量约为232 000,纯度达90%以上,浓度约为2 mg/mL。Acr2蛋白经变性-复性处理后可恢复其天然二级结构,且在48℃条件下可与变性的苹果酸激酶(malate dehydrogenase,MDH)形成稳定复合物。结论 Acr2蛋白经变性-复性处理后可恢复其天然分子构象,且具有体外分子伴侣活性。本研究为制备具有天然活性的结核杆菌蛋白抗原提供了新策略。