大肠埃希菌AcrAB-TolC外排泵表达水平调控机制的研究进展

AcrAB-TolC外排泵的过量表达是引起大肠埃希菌多重耐药的主要原因。AcrAB-TolC外排泵的表达水平主要受其正向调节因子、负向调节因子以及环境中的化学物质等调节。本文综述了近年来AcrAB-TolC外排泵调控因子方面的研究进展。

大肠杆菌的AcrAB-TolC多药外排泵及其调控研究进展

多药外排泵造成了细菌的多种药物的耐药现象,这对感染性疾病的防治提出了挑战。对于多药外排泵的研究不仅使人们认识细菌耐药性机制,而且为细菌耐药性的防治提供思路。大肠杆菌AcrAB-TolC外排泵系统的结构和调控机制研究取得了一些新进展,这为病原菌的相关研究提供了参考,本文对其进行了综述。

志贺菌主动外排泵acrAB-tolC及调控基因marOR突变与耐药的关系

目的:研究志贺菌的耐药状况,检测临床分离志贺菌主动外排泵acrAB-tolC基因及调控基因marOR的突变情况,并探讨其与耐药性的关系。方法:对159株临床分离的志贺菌进行四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、诺氟沙星、复方新诺明6种药物的药敏试验和有机溶剂耐受试验,对其acrAB-tolC基因和marOR基因进行聚合酶链反应(PCR)扩增,并进行限制性内切酶酶切与单链构象多态性(SSCP)分析。结果:159株临床分离的志贺菌属细菌筛选出4株敏感株、18株耐单药株和137株耐多药株,耐多药率为86.2%(137/159);159株中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7%(122/159);159株均扩增出acrAB-tolC基因和marOR基因,未发现基因缺失株;单链构象多态性分析,155株耐药菌株中,marOR基因的突变率为17.4%,acrA基因的突变率为5.8%,acrB基因的突变率为3.9%,tolC基因的突变率为2.6%;4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变。结论:临床分离的志贺菌耐多药率和有机溶剂耐受率均较高,且存在较高的marOR基因突变率。

细菌AcrAB-TolC型外排泵中AcrA蛋白的进化分析

研究不同耐药细菌AcrAB-Tolc型外排泵中关键蛋白AcrA的序列,针对其保守及非保守氨基酸残基进行该类蛋白的进化分析,构建蛋白进化树。收集来源于不同细菌的已知序列的AcrA蛋白,去除冗余并进行序列比对之后,根据其序列比对结果的相似性、氨基酸残基的保守性研究其进化特征。结果表明,不同细菌的AcrA蛋白部分氨基酸残基具有高度的保守性,这与其实现生物学功能有关,非保守区域是主要的进化区域。可为不同菌株的进化提供参考,同时为以AcrAB-Tolc型外排泵为靶标的新药研究提供相关数据。

苦参碱逆转外排泵系统AcrAB-ToIC介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素的耐药性

目的评估苦参碱对由外排泵AcrAB-TolC介导的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对替加环素耐药的影响并探究其逆转耐药性的相关调控机制。方法使用棋盘稀释法,分别设置阴性对照组、阳性对照组、替加环素组、苦参碱组、联合用药组;培养24 h后,酶标仪测定吸光度,记录各药物组的最低抑菌浓度(MIC)、计算抑菌率和部分抑菌浓度指数(FIC);取各药物组MIC对应孔和阳性对照孔,使用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术检测AcrAB-TolC外排泵系统调控基因AcrB、MarA、RamA、AcrR的表达情况。结果与单用替加环素或苦参碱相比较,替加环素与苦参碱联合应用能更明显的抑制外排泵系统AcrAB-TolC介导的替加环素耐药的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的生长(P<0.05),替加环素与苦参碱的药理主要表现为协同或相加作用;联合用药下,替加环素与苦参碱的MIC值均明显降低,替加环素的MIC均能恢复至替加环素敏感MIC值;苦参碱单独或联合作用后,AcrAB-TolC外排泵RamA、AcrB表达明显降低(P<0.05),AcrR基因表达明显升高(P<0.05)。结论苦参碱能下调耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的AcrAB-Tolc外排泵调控蛋白RamA和AcrB基因的表达、及上调AcrR基因的表达,起到逆转替加环素耐药的作用。

AcrAB-TolC电泵系统介导的鼠伤寒沙门菌多重耐药机理研究

目的探讨AcrAB-TolC电泵系统在鼠伤寒沙门菌产生多重耐药中的作用。方法利用基因敲除技术,敲除多重耐药鼠伤寒沙门菌野生株X2的acrAB基因和tolC基因,获得两个突变株△tolCX2和△acrABX2。通过基因敲除前后细菌耐药水平的改变,验证AcrAB-TolC系统在鼠伤寒沙门菌产生多重耐药中的作用。结果△tolCX2和△acrABX2对万古霉素耐药,对丁胺卡那霉素、头孢曲松敏感,与野生株X2一致;但对11种抗生素由耐药变为敏感。结论AcrAB-TolC系统与鼠伤寒沙门菌多重耐药的产生有关。

阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因的相关性研究

目的了解阴沟肠杆菌AcrAB-TolC外排系统基因的携带情况,探讨其与阴沟肠杆菌对常用抗菌药物耐药之间的关系。方法采用法国梅里埃Vitek 2 compact仪对临床分离的136株阴沟肠杆菌进行鉴定和药敏;采用PCR法检测AcrABTolC外排系统acr A,acr B,acr R和tol C四种基因在阴沟肠杆菌中的分布情况,并根据检测结果进行耐药率分组比较。结果136株阴沟肠杆菌对头孢曲松的耐药率达52.2%,对亚胺培南的耐药率高达15.4%;AcrAB-TolC外排系统tol C基因的检出率最高(95.6%),其次为acr R基因(80.9%),acr A基因的检出稍低(70.6%),acr B基因的检出率最低(61.7%)。同时携带四种基因的菌株最多,占36.8%;各外排系统基因阳性组的耐药率均高于阴性组。结论阴沟肠杆菌耐药问题较严峻,AcrAB-TolC外排系统acr A,acr B,acr R和tol C四种基因在阴沟肠杆菌中普遍且存在差异性,并在多药耐药形成中发挥了重要作用。

AcrAB-TolC外排泵在多重耐药肠杆菌中的作用研究进展

耐多药肠杆菌的出现严重威胁着人类健康。AcrAB-TolC外排泵的过量表达是引起肠杆菌多重耐药的主要机制之一,其主要由周质融合蛋白AcrA、外膜通道蛋白TolC和药物质子转运子AcrB构成,受整体调控因子、局部调控因子以及环境中的化学物质等调节。对AcrAB-TolC外排泵的研究,不仅有助于阐明相关耐药本质,还有助于研制有临床意义的外排泵抑制剂(EPIs),为解决肠杆菌多重耐药问题提供新思路。本文对AcrAB-TolC外排泵的结构、调控等方面的研究进展作一综述。

代谢工程强化tolC缺失大肠杆菌的血红素合成

血红素作为生物体可利用的铁源应用于食品和医疗领域。利用微生物发酵生产血红素具有工业前景但产量偏低,该研究利用代谢工程改造大肠杆菌,提高菌体血红素合成水平。通过构建tolC缺失大肠杆菌,进而过表达hemA、hemH,外源添加Fe^(2+)的方式实现血红素产量的提升。结果表明,在tolC缺失菌株WTΔT中过表达hemA导致卟啉的积累;在外源添加80μmol/L的Fe^(2+)时,共表达hemA与hemH的菌株WTΔT-AH,胞内血红素含量达到40.18μmol/L,是野生菌WT的3.98倍。该研究为使用重组大肠杆菌高效生产血红素提供了一定的理论依据和潜在的应用价值。

志贺菌属外排泵AcrAB-TolC及其调控基因突变与氟喹诺酮耐药性的关系

目的探讨临床分离耐氟喹诺酮志贺菌外排泵Acr AB-Tol C基因及其调控基因mar OR、acr R、sox S突变与耐药性的关系。方法使用K-B纸片扩散法筛选临床耐药菌,测定加入泵抑制剂羰基氢氯苯腙(CCCP)后萘啶酸、左氧氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)的变化,PCR扩增外排泵基因acr A、acr B及其调控基因mar OR、acr R、sox S并测序。结果 159株志贺菌中共筛选出11株氟喹诺酮耐药菌株;加入质子泵抑制剂后2株耐药菌株对氟喹诺酮类抗菌药的MIC下降;7株耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC不变;2株耐药菌对氟喹诺酮类抗菌药的MIC上升。基因测序发现氟喹诺酮耐药菌株外排泵Acr AB-Tol C调控基因mar OR第36、37、38、39位存在CATT碱基缺失。结论泵抑制剂可部分抑制外排泵的活性。mar OR突变可能与志贺菌对氟喹诺酮类抗菌药耐药有关。

AcrAB外排泵ramA对肺炎克雷伯菌耐喹诺酮类药物的影响

目的探讨AcrAB外排泵调控基因ramA对肺炎克雷伯菌耐喹诺酮类药物的影响。方法用喹诺酮类药敏纸片扩散法、MIC及其逆转实验和有机溶剂耐受实验测定细菌耐药表型,用PCR扩增外排泵结构基因acrA、acrB、tolC及调控基因acrR,ramA,marA,用半定量PCR检测调控基因的转录水平。结果泵的结构基因和调控基因均存在43株KP菌中。仅喹诺酮类耐药株与敏感株ramA转录水平存在统计学差异(P<0.05)。和对照组相比,高表达ramA的AC-1株,其泵结构基因的转录水平增高,耐药表型也有明显改变,用泵抑制剂后,其喹诺酮类的MIC恢复对照水平。结论 ramA是KP菌耐喹诺酮类抗生素的一个重要因素。抑制ramA的表达,有助于治疗多重耐药肺炎克雷伯菌的感染。

以大肠埃希菌tolC蛋白为靶标的适配体的筛选及结构分析

目的:筛选大肠埃希菌外排泵tolC蛋白的核酸适配体。方法:重组表达大肠埃希菌外排泵外膜蛋白tolC,利用指数富集的配体系统进化技术(stematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)从单链DNA文库中筛选出一组能够特异性与其结合的核酸适配体。利用FITC荧光素标记技术检测每轮单链DNA文库与靶蛋白的亲和力,直至亲和力的上升趋于饱和,将最后一轮筛选产物克隆测序,并用DNAman软件分析其二级结构。结果:经过12轮筛选,单链DNA文库与靶标蛋白的亲和力趋向稳定,将第12轮筛选产物克隆测序,对获得的23个适配体进行分析。一级结构分析显示23个适配体并无共同的保守序列,但分别有3对和2对适配体序列完全一致。二级结构预测分析表明,茎环结构为适配体主要的结构形式,提示其可能是适配体与tolC蛋白蛋白特异性结合的基础。根据二级结构特点可将23个适配体分为4个家族,其中20号适配体与靶标蛋白亲和力最高。结论:成功利用SELEX技术筛选获得了特异结合tolC的高亲和力的核酸适配体,为大肠埃希菌耐药干预及机制研究奠定了基础。

TolC表达量与大肠埃希菌K-12耐四环素的研究

随着抗生素的开发与使用,细菌在对多种抗生素的适应过程中逐渐发展出对抗生素耐药的反应机制。TolC是药物排出转运体系的外膜成分,与AcrAB一起形成主要的药物排出泵,有关其表达量与耐药间的关系目前尚不清楚。试验将tolC克隆到pET-32a载体上进行诱导表达,镍柱纯化,免疫新西兰大白兔,获得1:4000的抗血清。Western blotting分析表明,TolC的表达量在耐四环素的大肠埃希菌K-12中比对照组提高50%。细菌TolC高表达试验发现,其MIC从100μg/ml提高到200μg/ml。结果说明TolC的表达量与四环素耐药性直接相关,提示细菌可以通过调节外膜蛋白的表达实现对抗生素的耐受。

肠杆菌科AcrAB多药外排泵分子演化分析

目的:分析肠杆菌科AcrAB多药外排泵的分子演化规律,为多药耐药性病原菌的防治提供基础数据。方法:从NCBI获得肠杆菌科物种AcrAB多药外排泵相关蛋白和核酸序列,采用分析软件,分析肠杆菌科物种AcrAB多药外排泵相关序列。结果:在肠杆菌科各物种AcrA、AcrB和AcrR与大肠埃希氏菌同源性在55%、75%和43%以上。AcrA保守位点分散,在N端和C端较少,在分子一级结构中段较多。AcrB跨膜序列保守性较高,与质子转移相关的三个位点D407、D408和K940以及稳定这三者结构的T978在肠杆菌科完全保守,其一级结构上相邻位点也保守。AcrR序列整体保守性较低,但HTH区域保守性高。与AcrR结合的回文结构及周围序列保守性高,在"茎"结构中仅存在一个氨基酸的差异。结论:AcrAB多药外排泵在肠杆菌科中广泛存在,有一定的保守性。分析肠杆菌科AcrAB多药外排泵有助于病原菌多药耐药性的防治。

主动外排系统acrAB在临床分离肺炎克雷伯菌中的分布和表达

目的:研究临床分离多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制,检测肺炎克雷伯菌中有无类似大肠埃希菌主动外排系统AcrAB的结构基因acrAB的分布和表达。方法:用聚合酶链反应(PCR)检测acrAB基因在临床分离的肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌标准菌株(ATCC 10031)中分布,用逆转录(RT)-PCR测定其 mRNA表达水平,并对 PCR扩增的 ATCC 10031的acsAB基因片段进行序列分析,同大肠埃希菌acrAB基因的相应序列进行同源性比较。结果:在所有被检的临床分离肺炎克雷伯菌和 ATCC 10031的染色体中均发现有类似大肠埃希菌的 acrAB基因;肺炎克雷伯菌多重耐药菌株 acrAB的 mRNA水平显著高于敏感野生株和耐药谱不同的菌株,而耐药谱不同的菌株仅略高于敏感菌株;PCR扩增的 ATCC 10031的 acrAB基因片段同大肠埃希菌acrAB基因相应片段,在核苷 序列上具有很高的同源性。结论:本研究表明在肺炎克雷伯菌中有类似大肠埃希菌的acrAB基因存在,其表达水平决定了多重耐药表型。

主动外排系统acrAB在临床分离大肠杆菌中的分布和表达

为了研究临床分离多重耐药大肠杆菌的耐药机制，我们采用ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测大肠杆菌主动外排系统ＡｃｒＡＢ结构基因ａｃｒＡＢ在临床分离菌株中的分布并用ＲＴ－ＰＣＲ测定其ｍＲＮＡ表达水平。结果在所有的临床分离大肠杆菌染色体中均发现有ａｃｒＡＢ基因，未发现ａｃｒＡＢ缺失株；大肠杆菌多重耐药株ａｃｒＡＢ的ｍＲＮＡ水平明显高于敏感野生株和其它耐药谱不同的菌株，而敏感野生株和耐药谱不同的菌株间无差别。本研究表明大肠杆菌ａｃｒＡＢ表达水平决定了大肠杆菌多重耐药表型，ｍａｒ可能调控ａｃｒＡＢ的表达。

伤寒沙门菌多重耐药acrAB全基因的检测及序列分析

目的 :伤寒沙门菌 2 75主动外排系统acrAB全基因测序并分析其结构。方法 :以伤寒沙门菌基因序列为参考设计引物 ,以PCR法对伤寒沙门菌 2 75acrAB全序列进行调取并测序。结果 :伤寒沙门菌 2 75acrAB全序列与参考伤寒沙门菌 (No .AL6 2 72 6 7)同源性 99.38% ,与大肠杆菌 (No .U0 0 734)同源性 84 .6 9%。伤寒沙门菌 2 75acrR正向编码 2 17个氨基酸 ,acrA反向编码 397个氨基酸 ,acrB反向编码 10 4 9个氨基酸 ,同参考伤寒沙门菌比较 ,acrR相同 ,acrA、acrB各一处不同 ;与大肠杆菌比较 ,同源性分别为 86 .98%、91.6 9%、94 .6 6 %。acrA、acrR启动区位于 4 36 7～ 4 5 0 7碱基处 ,SD序列 (RBS)位于 4 373～ 4 377碱基处。acrA与acrB间隔区位于 315 1～ 3172碱基处 ,SD序列 (RBS)位于 316 1～ 316 5碱基处。结论 :伤寒沙门菌acrAB主动外排系统在结构、碱基序列和编码的氨基酸序列上均与大肠杆菌有很高的同源性 ,它可能是伤寒沙门菌引起多重耐药的主要原因。

迟缓爱德华菌FliC-TolC融合蛋白表达及免疫特性研究

鞭毛蛋白FliC与外膜蛋白TolC均具有免疫保护效果,其中FliC蛋白具有疫苗佐剂的特性,但目前尚未有关迟缓爱德华菌(E.tarda)FliC-TolC融合产物免疫动物的免疫效果的相关报道。为研究E.tarda FliC-TolC融合蛋白的免疫特性,本研究利用融合PCR方法扩增获得fliC-tolC片段,构建重组载体pET-28a-fliC-tolC,并利用E.coli BL21表达系统表达了融合蛋白FliC-TolC。将纯化的FliC-TolC、TolC、FliC蛋白免疫小鼠后,以E.tarda强毒株攻毒评估免疫效果;并利用斑马鱼模型进行了平行试验。结果显示,本研究克隆了E.tarda fliC-tolC基因并表达和纯化了相应重组蛋白FliC-TolC;FliC-TolC蛋白激发小鼠产生的抗体水平优于FliC、TolC蛋白单独免疫组,表明FliC-TolC蛋白具有优良的免疫原性。攻毒试验表明FliC-TolC蛋白组小鼠对强毒株可产生较好的抵抗力,相对保护率为95%;斑马鱼攻毒试验相对保护率为60%。本研究证实了E.tarda重组蛋白FliC-TolC的免疫效力,为进一步研制E.tarda亚单位疫苗提供了参考和借鉴。

鼠伤寒沙门菌cpxR和tolC双基因缺失株的构建及其对抗菌药物敏感性分析

为了探索CpxAR和AcrAB-tolC的协同作用对鼠伤寒沙门菌多重耐药性的调控机制,利用噬菌体转导技术,以前期构建的鼠伤寒沙门菌(JS)的tolC缺失株JSΔtolC::kan为供体菌,以cpxR缺失株JSΔcpxR为受体菌,在P22噬菌体的作用下成功构建了JS的双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC::kan;再利用pCP20质粒消除卡那抗性基因kan,获得了JSΔcpxRΔtolC,并构建了cpxR回补株JSΔcpxRΔtolC/p cpxR。采用微量肉汤稀释法测定了12种常用抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:tolC缺失株对环丙沙星、头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、头孢噻呋、氟苯尼考、土霉素、恩诺沙星、阿米卡星的MIC值分别降低至JS的1/8、1/2、1/4、1/8、1/8、1/2、1/16、1/4、1/4、1/8、1/2;cpxR和tolC双基因缺失株对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的MIC均又进一步降低至tolC缺失株的1/2;而将cpxR基因回补到双基因缺失株JSΔcpxRΔtolC中后,对环丙沙星、头孢噻肟、头孢噻呋的MIC值均升高了2倍,对恩诺沙星的MIC升高至4倍,对头孢喹肟的MIC升高了8倍。说明cpxR缺失与tolC缺失的协同作用能增强鼠伤寒沙门菌对头孢噻肟、头孢喹肟、多西环素、痢菌净、喹乙醇、恩诺沙星的敏感性。