产单核细胞李斯特菌actA基因在大肠杆菌中的表达及其单克隆抗体的研制

利用PCR技术从血清型1／2a的产单核细胞李斯特菌Lm-4株中扩增出actA基因，经克隆筛选和测序鉴定后，构建成该基因的原核表达载体pGEX-6P-1-actA及pET-actA，转入E．coli后，IPTG诱导目的蛋白的表达。SDS-PAGE结果表明，actA基因在两种载体中均获得表达，融合蛋白的大小分别约为120kDa和97kDa。以纯化蛋白为材料进行了AetA单抗的研制，获得4株抗ActA的单克隆抗体杂交瘤细胞株，腹水单抗ELISA效价为1：5×10^4-1：1×10^5。选取单抗1A5进行Western blot分析，结果表明单抗1A5能和表达产物进行特异性反应，且与Lm-4多抗血清的Western blot结果一致。actA基因的原核表达及单抗的研制为研究ActA蛋白的生物学活性及其致病作用奠定了基础。

单增李斯特氏菌actA基因的克隆及原核表达

利用PCR技术从单增李斯特氏菌中扩增出actA基因,将PCR产物纯化后克隆到pMD 18Tsimple vector中,成功构建出克隆载体pMD-18T/actA。以BamHⅠ和EcoRⅠ分别双酶切pMD-18T/ActA和表达载体pGEX-3X,将纯化的actA基因亚克隆到表达载体pGEX-3X。构建的重组表达载体pGEX-3X/ActA转化到E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE分析,可见约120 ku外源蛋白带,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应。该研究为ActA的生物学特性和功能的研究及诊断试剂的研制奠定了基础。

基于ActA基因的单核细胞增多性李斯特菌的序列分型研究

根据单核细胞增多性李斯特菌ActA基因序列保守区设计一对引物，对21个菌株进行PCR扩增，得到长度为820bp的片段。PCR产物经过纯化后直接测序，并对其中的506bp进行同源性分析。结果表明单核细胞增多性李斯特菌分离株具有5个明显不同的克隆谱系，每个谱系的同源性均在95％～100％。16个单核细胞增多性李斯特菌奶相关和环境分离株可被分成4个谱系，其中2个谱系（C、D）均为奶相关分离株和成品奶分离株；加工厂地面污水分离株为独立的一个谱系。初步表明，成品奶中污染的单核细胞增多性李斯特菌来自于奶牛场，而非加工环境。

基于单核细胞增生李斯特菌actA基因的环介导等温扩增技术快速检测方法的建立

单核细胞增生李斯特菌(Lm)是主要的食源性致病菌之一,也是一种重要的人畜共患病原菌,感染人和动物后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症等。为建立快速检测Lm的方法,本研究以Lm毒力因子actA作为特异性检测的靶基因,通过条件优化初步建立了快速检测食源性Lm的环介导等温扩增(LAMP)方法。并采用该方法进行了特异性、敏感性及临床样品检测试验。结果显示,利用建立的LAMP方法检测Lm、肠出血性大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、小肠结肠炎耶尔森菌、产气荚膜梭菌、空肠弯曲菌、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪丹毒丝菌或支气管败血波氏杆菌基因组DNA,除Lm为阳性外,其他病原菌均为阴性,表明该方法的特异性较强;将Lm菌液10倍倍比稀释为4.7×10^(9)cfu/mL~4.7×10^(0)cfu/mL,再采用该LAMP方法和常规PCR方法进行检测,结果显示,LAMP对Lm的检测下限为4.7×10^(1)cfu/mL,而常规PCR对Lm的检测下限为4.7×10^(3)cfu/mL,即LAMP比普通PCR的敏感性高100倍,表明本研究建立的LAMP方法敏感性较高;采用建立的LAMP方法对118份猪肉临床样品进行检测,结果显示有3份样品为阳性,与常规PCR和国标的检测结果均一致。本研究基于Lm actA基因建立了Lm LAMP检测方法,且该方法具有特异性强、敏感性高、结果可视等优点,适用于实验室和基层食品安全监管部门的现场快速检测。

单核细胞增生李斯特菌XS5野毒株肌动蛋白actA基因克隆与序列分析

研究以从新疆绵羊病料中分离的LMXS5野毒株的基因组DNA为模板,根据已知的LM的actA基因序列,设计特异性引物,然后通过PCR技术对LM新疆野毒株肌动蛋白actA基因进行扩增、克隆和测序,并与标准毒株基因进行比对分析,结果XS5流行株actA基因全长均为1 797 bp,与GenBank登录的LM标准强毒株(ATCC19114) actA基因相比,XS5株actA基因存在51个不同的变异位点,其中同义突变26位点,错义突变25位点,引起25个氨基酸发生改变。该研究为LM actA基因遗传变异研究奠定一定的基础。

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建ACTA1基因敲除的PEFs细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts, PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。

ACTA2基因在人肿瘤中致癌作用的泛癌分析

目的:研究ACTA2基因在人肿瘤组织的表达、预后相关性、基因变异和免疫浸润等情况,进而探究其临床意义。方法:使用TIMER2.0、GEPIA2、HPA数据库及仙桃学术网站,分析各种类型肿瘤组织中ACTA2的表达情况及其与预后的相关性。使用cBioPortal数据库分析ACTA2基因变异情况。使用TIME2.0分析ACTA2在肿瘤中的免疫浸润水平。使用STRING、GEPIA2、Veen网站和R包进行ACTA2相关基因的富集分析。结果:胶质细胞瘤、肝癌、胰腺腺癌等肿瘤组织中,ACTA2高表达与预后不良相关;子宫内膜癌组织中ACTA2低表达与预后不良相关(均P<0.05)。ACTA2最主要的变异类型是拷贝数缺失。ACTA2的表达与多形成性胶质细胞瘤及肺腺癌等的肿瘤相关成纤维细胞浸润水平呈正相关(均P<0.05)。ACTA2相关基因的富集分析显示,肌动蛋白细胞骨架调节、血管平滑肌收缩参与了ACTA2的功能机制。结论:ACTA2表达与临床预后、基因变异及免疫浸润水平相关,ACTA2可能作为多种肿瘤新的生物标记物。

单核细胞增生李斯特菌毒力基因inlB/actA双缺失突变株的构建

单核细胞增生李斯特菌inlB和actA毒力基因的编码产物InlB和ActA是与其致病性相关的重要毒力因子,与该菌在细胞间扩散、传播有着直接的关系,其中肌动蛋白聚集因子ActA是细菌由细胞浆扩散至相邻细胞所必须的因子,而内化素InlB在对肝细胞的侵袭过程中起着重要作用。本研究中利用同源重组技术在inlB缺失菌株基础上成功构建了毒力基因inlB和actA双缺失的突变株,获得减毒突变株,为构建预防人类和动物疾病的疫苗载体奠定了基础。

延边黄牛ACTA1基因的SNPs检测及其与肉质性状的关联分析

试验旨在研究延边黄牛ACTA1基因的遗传变异,分析其多态性对肉质性状的影响。采用PCR-RFLP和PCR-SSCP方法探讨ACTA1基因多态性及其与肉质性状的关联性。结果发现,延边黄牛ACTA1基因存在2个突变位点:A193G突变,导致氨基酸Arg→Gly的错义突变;A298G突变,导致氨基酸Lys→Arg的错义突变。χ2检验显示,A193G和A298G位点于检测群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。关联分析显示,延边黄牛ACTA1基因2个突变位点的不同基因型与肌肉中肉豆蔻酸、油酸含量、眼肌面积、大理石花纹等级呈显著相关(P<0.05)。初步认为ACTA1基因对延边黄牛肉质性状有显著影响,可作为延边黄牛新品种早期选择的候选基因。

槟榔江水牛ACTA1基因多态性与生长性状的相关性研究

[目的]揭示α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因多态性与槟榔江水牛生长性状的相关性。[方法]采用PCR扩增及基因测序技术研究了槟榔江水牛ACTA1基因多态性,并分析了该基因变异与水牛生长性状的关联关系。[结果]检测到槟榔江水牛ACTA1基因存在2个SNP位点,分别位于第5内含子与第6外显子,水牛ACTA1基因变异与体重、管围等性状存在显著相关。[结论]本研究首次检测了槟榔江水牛ACTA1基因多态性与生长发育性状的关联关系,为槟榔江水牛遗传资源保护利用及标记辅助选择提供了理论依据。

GFP用于单核细胞增生李斯特菌PrfA调控毒力基因actA转录表达的研究

PrfA是单核细胞增生李斯特菌(LM)中迄今为止发现的惟一个调控绝大多数毒力基因转录表达的蛋白因子。为了研究PrfA转录调控毒力基因表达的分子机制,将无启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因与毒力基因actA的启动子融合,连接到穿梭载体pLSV16质粒上,构建成表达融合载体pLSV16-PactA-gfp,然后将其电转化入LM野生株P14、PrfA高表达突变株P14a和prfA基因等位缺失突变株A42中表达。利用荧光显微镜和荧光酶标仪检测上述3株细菌中绿色荧光蛋白的不同表达强度,从而评价actA基因依赖于PrfA的转录活性强弱。结果显示,绿色荧光蛋白在P14a中发出的荧光强度最高,P14次之,A42最弱,两两比较均有显著差异(P<0.01),表明毒力基因actA的转录水平高低与PrfA的活性成正相关,其转录表达依赖于PrfA的调控;该试验同时也显示GFP能方便、有效地用于研究PrfA调控LM不同毒力基因的转录表达水平。

类乌齐牦牛ACTA1基因克隆、分子特性及差异表达分析

【目的】骨骼肌α肌动蛋白1(actin alpha1,ACTA1)主要参与骨骼肌纤维的发育,在骨骼肌活动中发挥重要作用。本试验主要扩增类乌齐牦牛ACTA1基因的cDNA序列,检测ACTA1基因在类乌齐牦牛不同组织中mRNA水平的表达规律。【方法】采用RT-PCR方法扩增并克隆类乌齐牦牛ACTA1基因CDS区;通过在线软件对其一级结构、二级结构、三级结构进行生物信息学分析;利用核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性和系统进化树分析;应用RT-qPCR技术检测ACTA1基因在类乌齐牦牛不同组织中的表达模式。【结果】类乌齐牦牛ACTA1基因编码区全长1134bp,结构稳定,共编码377个氨基酸。生物信息学分析发现,类乌齐牦牛ACTA1基因编码的蛋白质是一种结构较稳定、带负电的亲水性蛋白,二、三级结构以α-螺旋为主,包含2个明显的跨膜区域,无信号肽,属胞内蛋白。保守结构域中含有明显的NDB区域,蛋白结构高度保守。同源性分析表明,类乌齐牦牛与水牛ACTA1基因的核苷酸及氨基酸同源性均较高。系统进化树分析显示,类乌齐牦牛与水牛亲缘关系最近,黄牛次之。实时荧光定量PCR结果显示,ACTA1基因在臀肌和大脑高表达。【结论】获得类乌齐牦牛ACTA1基因的CDS区全长1134bp,ACTA1基因在类乌齐牦牛肌肉和大脑组织中显著表达,为进一步研究分析ACTA1基因在调控牦牛肌肉发育及机制等方面奠定基础。

牦牛ACTA1基因启动子区克隆、DNA甲基化与组织表达相关性分析

为了探究骨骼肌α肌动蛋白1(ACTA1)基因在肌肉和脂肪等6个组织中的甲基化状态及mRNA表达水平,以类乌齐牦牛、麦洼牦牛为研究对象,成功克隆了牦牛ACTA1基因启动子区序列,且采用重亚硫酸氢盐测序法(BSP)检测ACTA1基因启动子区甲基化模式,并通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪组织中的mRNA表达水平。结果显示,牦牛ACTA1基因转录起始位点上游及第一外显子区部分序列总长为1028 bp;BSP法分析发现肌肉组织DNA甲基化水平最低,脂肪组织甲基化率最高,其中,类乌齐牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为6.25%,6.88%,20.00%,16.25%,26.25%,29.38%,麦洼牦牛臀大肌、心脏、肾脏、肺脏、肝脏和脂肪的甲基化概率分别为5.00%,7.50%,18.13%,20.00%,26.25%,28.75%;ACTA1基因mRNA表达量在肾脏、肺脏、肝脏和脂肪均极显著低于臀大肌(P<0.01),且显著低于心脏(P<0.05),类乌齐牦牛和麦洼牦牛心脏mRNA表达量具有显著性差异(P<0.05),类乌齐牦牛肺脏组织甲基化率显著低于麦洼牦牛(P<0.05),其他各组织甲基化率和mRNA表达量差异均不显著(P>0.05),各组织甲基化水平与ACTA1基因mRNA表达量呈极显著负相关(r=-0.797,P=0.002)。结果表明,ACTA1基因DNA甲基化模式对肌肉发育具有一定的调控作用,可为牦牛遗传育种表观遗传标记提供部分数据支持。

亚洲黑熊(Ursus thibetanus)α-肌动蛋白ACTA1基因的克隆及序列分析

为了解亚洲黑熊(Ursus thibetanus)的α-肌动蛋白ACTA1基因的结构特征和其编码蛋白功能,试验采用PCR技术从亚洲黑熊肌肉组织的总DNA和RNA中扩增α-肌动蛋白ACTA1基因,并对其基因表达和序列进行克隆、测序。采用ORF finder软件进行DNA序列ORF的查找和氨基酸序列的推定;采用Gen scan对结构基因序列进行分析;通过DNAMAN Version 6.0软件对基因编码序列和氨基酸序列进行比较;采用MEGA 7.0软件进行亲缘性比较;利用ExPASy软件预测分析了蛋白质功能位点和生化特性。结果表明:亚洲黑熊ACTA1基因的ORF为1 134 bp,编码377个氨基酸;ACTA1蛋白等电点为5.24,分子质量为42 ku,具有1个N-糖基化位点、10个N-肉豆蔻酰化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,以及1个依赖cAMP和cGMP蛋白激酶磷酸化位点。亚洲黑熊和北极熊之间的ACTA1基因编码序列的同源性最高,达到86.1%。ACTA1蛋白相对保守且具有较高亲水性及较多的螺旋结构,并具有跨膜螺旋和多核苷酸的结合位点。说明ACTA1基因高度保守,ACTA1蛋白具有多种宏观及微观生物学功能,并参与了信号转导过程,在亚洲黑熊生长发育、生物调控及修复中起重要作用。

牛ACTA1基因的生物信息学分析

应用RT-PCR方法克隆牛ACTA1基因,利用生物信息软件对该基因进行生物信息学分析。结果表明:牛ACTA1基因CDS为1 134 bp,编码377个氨基酸;拓扑预测表明,ACTA1编码的蛋白质可能存在4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,8个豆蔻酰化位点,含有1个ACTIN保守的结构域。研究结果为进一步了解牛ACTA1基因调控肉质性状的分子机理提供了有益参考。

延边黄牛α-肌动蛋白1基因的多态性及其与生长性状的相关分析

试验旨在寻找肌内脂肪含量差异极显著的两组个体延边黄牛背最长肌组织差异表达基因,并分析其遗传多态性对生长性状的影响。应用引物退火技术获得了在肌内脂肪含量差异极显著的两组个体背最长肌组织差异表达α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因及其全长cDNA序列,该基因主要在心脏和背最长肌中表达。序列比对结果发现,在5′端非编码区193bp处存在1个突变。采用PCR-RFLP方法对100头延边黄牛群体进行检测,发现AA、AG、GG 3种基因型,基因型频率分别为0.24、0.50、0.26;A、G等位基因频率分别为0.37、0.63。对该突变位点的多态性与生长性状的关联性进行分析,结果发现,在体长、体重和平均日增重上,GG基因型个体显著高于AA和AG基因型个体(P<0.05);在胸围上,GG基因型个体显著高于AG基因型个体,但与AA基因型个体差异不显著(P>0.05);在体高上,不同基因型之间差异不显著(P>0.05)。初步认为GG基因型是提高延边黄牛体质量和体尺指标性状的有利基因型,提示ACTA1基因有可能作为延边黄牛生长性状的候选基因。

中国烟雾病患者主动脉平滑肌肌动蛋白α2基因编码区的研究

目的探讨主动脉平滑肌肌动蛋白α2（actin alpha 2,ACTA2）编码区基因多态性/突变与中国烟雾病患者遗传易感性的关系。方法我院2012年6月～2013年5月经脑血管造影或磁共振血管造影检查明确诊断132例烟雾病,抽取患者的静脉血,通过聚合酶链式反应Sanger方法对外显子2～9进行直接测序分析ACTA2编码区多态性及罕见突变,对比分析人类基因突变数据库中报道的ACTA2基因突变。结果 132例中国烟雾病ACTA2基因编码区未检测到突变。结论ACTA2基因不是中国烟雾病患者的主要易感基因。

1例ACTA1基因突变导致先天性肌病胎儿的超声检查及遗传学分析

目的探讨1例四肢姿势异常胎儿的遗传学病因,并进行遗传咨询以及再生育指导。方法选取1个初次妊娠胎儿超声提示四肢姿势异常的家系作为研究对象,收集临床信息,行羊膜腔穿刺,对该家系进行全外显子组测序分析以及Sanger测序验证,用在线生物信息软件对变异位点进行致病性预测以及对应氨基酸的保守性分析。结果超声提示胎儿胸腔积液伴颈背部皮肤软组织增厚,胎儿上下肢姿势较固定;家系全外显子组测序发现胎儿存在ACTA1基因新发杂合变异c.355G>A(p.Glu119Lys),功能预测软件对该变异的预测结果偏向于致病性变异,且该变异在多个数据库中均未见收录,既往研究显示ACTA1突变可导致先天性肌病。根据美国医学遗传学与基因组学学会相关指南,该变异为可能致病性变异(PP3_Strong+PP2+PS2_Supporting+PM2_Supporting+PM5_Supporting)。结论家系全外显子组测序为该异常胎儿找到了遗传学病因,为该家庭的遗传咨询提供了依据。另外,该研究通过发现新的变异位点拓展了ACTA1的突变谱,并且很好地描述了ACTA1相关肌病的宫内表型。

单核细胞增生李斯特菌LAMP检测方法的建立及应用

[目的]建立一种单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并对其检测敏感性、特异性进行评价。[方法]针对单增李斯特菌的actA基因序列,设计6条LAMP特异性引物,通过对LAMP反应体系中的反应温度、内外引物浓度比、镁离子浓度等各参数进行优化,确定最优反应体系。以单增李斯特菌株CMCC54006株为阳性对照,其他菌株为阴性对照,验证LAMP检测方法的特异性。将纯培养的单增李斯特菌菌液提取DNA后10倍梯度稀释为模板进行LAMP检测,以测定该检测方法灵敏度。[结果]建立了特异性检测单增李斯特菌的LAMP检测方法,优化后确定了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的终浓度比为1.6∶0.2,镁离子浓度为6 mmol/L,dNTPs浓度为1.6 mmol/L,反应温度为65℃。特异性检测结果显示,仅单增李斯特菌反应管中的反应液呈绿色,表明建立的检测方法具有较高特异性。以单增李斯特菌DNA为模板进行的LAMP检测结果显示,LAMP检测方法灵敏度为64 copies/mL。[结论]建立单增李斯特菌的LAMP检测方法,高效特异,灵敏度高,可直接观察检测结果,适合现场检测。

应用LAMP检测方法检测肉制品中的单增李斯特菌

本研究使用恒温环介导技术,以单增李斯特菌的肌动蛋白大会诱导蛋白聚集因子A(actA)基因设计引物,建立单增李斯特菌的LAMP快速检测方法。不同来源的13株单增李斯特菌LAMP检测均显示阳性,其他21种细菌LAMP检测显示阴性。使用使用本研究建立的LAMP方法检测肉类样品中的单增李斯特菌结果与细菌分离方法检测结果一致。