单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统的构建

来自于啤酒酵母2μm质粒的FLP/frt位点特异性重组系统可用于转基因植物(细胞)筛选完成后去除选择标记基因.水稻肌动蛋白actin基因启动子和玉米泛素ubiquitin基因启动子可有效驱动单子叶植物中外源基因的转录.为培育去除选择标记基因的抗盐耐旱单子叶转基因植物,构建了适合于单子叶植物的FLP/frt位点特异性重组系统.该系统由含有FLP重组酶基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Ubi-FLP-bar和含有frt位点的植物双抗(抗除草剂、抗盐耐旱)表达载体pCAMBIA1300-Ubi-TsPPasef-rt-alsf-rtm以及pCAMBIA1300-Actin1-AtNHX1f-rt-alsf-rtm组成.

香蕉Actin1启动子的分离及启动活性的分析

从香蕉基因组DNA中分离香蕉Actin1启动子序列,序列测定结果表明,该片段1253bp,包含完整的G-box和TATAbox,5'非翻译区和其下游的内含子,与文献报道序列的同源性达97.53%。以全长序列取代植物表达载体pCAMBIA3300上的35S启动子序列构建成瞬间表达载体pCAMBIA-Act1,以内含子序列HindⅢ和XbaⅠ双酶切片段(584bp)取代植物表达载体pBI121上的35S启动子,构建成瞬间表达载体pBI121-Act1-1。采用基因枪法对香蕉根、叶和果实的薄片进行转化,转化材料经培养3h,采用分光光度法测定各组织GUS的活性。结果表明,Actin1启动子在所转化的3种组织中均可启动报告基因的表达,表达活性与35S启动子接近,具有组成型表达的特点。内含子部分序列(584bp)也具有启动活性,但启动活性较低。

棘阿米巴原虫actin1基因原核表达载体构建与鉴定

棘阿米巴角膜炎的临床诊断比较困难,以角膜刮片的病原学诊断为主,样本采集困难,临床诊断率低。本研究构建了棘阿米巴原虫actin1基因进行原核表达载体,并进行鉴定。以棘阿米巴滋养体cDNA为模板,通过特异性引物,经聚合酶链反应,获得actin1基因开放阅读框（ORF）片段,进行克隆及序列分析,经双酶切,连接,构建重组表达载体pET22b（＋）-actin1。将重组载体转化入大肠杆菌（E.coli）DH5α,筛选出阳性菌落,经PCR扩增和酶切鉴定后,阳性质粒送样测序;提取阳性质粒,转化入E.coli BL21（DE＋）,1mol/L IPTG诱导重组蛋白r-actin1的表达。自棘阿米巴滋养体cDNA扩增得到约774bp的actin1基因片段;经PCR和酶切鉴定表明,重组表达载体pET22b（＋）-actin1构建成功;重组菌株BL21（DE＋）/pET22b（＋）-actin1,经培养、诱导、SDS-PAGE电泳,出现1条相对分子质量约为30 000重组蛋白条带,r-actin1表达诱导表达成功。成功构建重组表达载体pET22b（＋）-actin1,并诱导表达。