大鼠注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体的检测

目的观察大鼠重复给与携带肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(recombinant adenovirus carrying hep-atocyte growth factor gene,Ad-HGF)后,血清中抗腺病毒抗体的出现时间及消失规律。方法大鼠给与不同剂量的Ad-HGF共14次,利用病毒中和反应(细胞病变效应及绿色荧光方法)观察血清中抗腺病毒抗体。结果手术及正常对照组和实验组动物给药7次前血清处理的细胞均出现明显细胞病变效应及强荧光。之后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度的中和作用,停药后13周到14周抗体水平很低或已不存在。同时观察到动物性别及给药剂量大小无差异。结论大鼠肌注Ad-HGF 7次后,动物血清中可检测到抗腺病毒抗体,停药后13周或14周抗体基本消失,此结果对Ad-HGF的实际应用具有指导意义。

Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应

目的:观察Ad-HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ细胞)的转染表达及增殖效应.方法:以不同转染强度(50,100,200MOI)Ad-GFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞,感染后48h用流式细胞仪检测转染效率.并以最佳感染强度Ad-HGF转染ATⅡ细胞,ELISA方法检测转染后48,72h上清中HGF的表达水平.用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应.结果:感染强度为100MOI时,对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61%,以100MOI的Ad-HGF转染6×105细胞后48,72h上清中HGF的表达分别为(249.4±1.8)ng和(168.0±26.1)ng,且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用.结论:Ad-HGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达,表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.

比格犬注射重组腺病毒Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及中和抗体的检测

目的:观察Beagle犬重复给予Ad-HGF后血清中抗腺病毒抗体及抗肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)抗体的出现时间及消失规律.方法:将24只比格犬随机分为四组:正常对照组、手术对照组、Ad-HGF小剂量组(2.4×107pfu/kg)和Ad-HGF大剂量组(2.4×108pfu/kg).Ad-HGF各组犬给予不同剂量Ad-HGF共14次.在给药2次后分别利用病毒中和反应和ELISA方法检测血清中抗腺病毒抗体和抗HGF抗体.结果:手术组、正常对照组及实验组动物于给药前及给药3次时血清细胞均未出现明显中和反应.给药4次后各剂量组动物血清均对腺病毒有不同程度中和作用,至停药后12wk抗体水平很低或已不存在.各时间点血清样品中未检测到抗HGF抗体.结论:犬肌注Ad-HGF4次后动物血清中检测到了抗腺病毒抗体,停药4wk后抗体水平有不同程度下降,直至12wk后血清中腺病毒抗体基本消失.

Ad-HGF对老龄高血压高血脂大鼠炎症因子IL-10、NF-κBp65表达的影响

目的通过检测白细胞介素(IL)-10、核因子(NF)-κBp65在不同实验组中的表达变化,探讨人肝细胞生长因子重组腺病毒(Ad-HGF)作用于老龄高血压高血脂大鼠脑组织的安全性。方法 125只SD雄性大鼠,随机分为假手术组,老龄高血压高血脂大鼠模型组,老龄高血压高血脂模型大鼠枕大池注入Ad-HGF后10 d组、20 d组、30 d组。应用免疫组织化学法及实时荧光定量PCR检测大鼠脑组织炎症因子IL-10及NF-κBp65表达的变化。结果与假手术组相比,模型组IL-10、NF-κBp65水平显著升高(P<0. 05);与模型组相比,注药后10 d、20 d、30 d组IL-10水平显著升高,NF-κBp65水平显著降低(P<0. 05)。结论 Ad-HGF可以减轻老龄高血压高血脂模型大鼠脑组织炎症反应。

Ad-HGF修饰MSCs异体移植对烧伤创面愈合的作用

目的:探讨携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰的骨髓间充质干细胞(MSCs)局部异体移植对烧伤创面愈合的作用。方法:密度梯度离心法体外分离培养雄性Wistar大鼠MSCs,并以感染复数(MOI=100)体外转染Ad-HGF。30只雌性Wistar大鼠随机分为:MSCs治疗组(A组),Ad-HGF修饰MSCs治疗组(B组),Ad-GFP修饰MSCs治疗组(C组),Ad-HGF治疗组(D组),空白对照组(E组)。复制大鼠深Ⅱ度烧伤模型,将细胞悬液、病毒悬液及生理盐水于创面下多点注射。伤后3、5、7、14、21 d观察创面收缩率并采集创面标本,行HE染色观察创面愈合情况。结果:伤后7、14 dB组与A组、C组、D组、E组比较,创口收缩率显著提高(P<0.05);HE染色可见B组表皮明显厚于其他各组,并可见钉脚下伸。结论:Ad-HGF修饰MSCs异体移植可显著提高烧伤创面愈合速度和质量,为烧伤创面修复提供了新的策略。

Ad-HGF基因修饰的胎盘间充质干细胞治疗兔肢体缺血的实验研究

目的研究重组腺病毒介导肝细胞生长因子(adenoviral vector mediated human hepatocyte growth factor,AdHGF)修饰的胎盘源间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PMSC)在兔肢体缺血模型中促新生血管生成的作用。方法无菌取足月产妇胎盘胎儿面中心区域胎盘组织,胶原酶消化法分离干细胞,体外培养传代,感染Ad-HGF 48 h后收集细胞用于治疗兔肢体缺血实验。左侧治疗组后肢缺血肌肉组织内多点注射总细胞数5×106/ml Ad-HGF修饰的PMSC,右侧对照组后肢缺血肌肉组织内注射生理盐水。结果治疗后第14天腹主动脉穿刺行数字减影血管造影(digital subtraction angiography,DSA)检查,可见左侧肢体缺血治疗后微血管生成数明显多于未治疗右侧肢体,血管形成能力明显增强。苏木精伊红染色法(HE)后置光镜下观察显示,治疗组毛细血管密度明显大于未治疗组(P<0.05)。实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测后肢肌肉组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、HGF的表达明显升高(P<0.05)。结论经Ad-HGF基因修饰的PMSC能明显促进血管新生,加快局部缺血组织血流循环的重建,是治疗肢体慢性缺血的有效手段。

腺病毒介导人肝细胞生长因子对大鼠皮层神经元损伤的保护作用

目的 :探讨腺病毒介导人肝细胞生长因子 (Ad -HGF)对体外无血清培养所致大鼠皮层神经元损伤的保护作用。方法 :用流式细胞仪测定不同感染强度 (MOI)条件下携带绿色荧光蛋白的重组腺病毒 (Ad GFP) (2 5 ,5 0 ,10 0 ,2 0 0 pfu/cell)对皮层神经元的转染效率 ,确定最佳MOI ;ELISA测定Ad HGF在最佳感染强度下皮层神经元中的表达规律 ;通过中性红染色和PI Hoechst33342双染色法比较转染Ad HGF组与对照组 (转染Ad GFP组和空白对照组 )间无血清培养后 6h、12h、2 4h和 4 8h细胞的存活情况。结果 :在感染强度为 5 0 pfu/cell时 ,重组腺病毒对皮层神经元的转染率达 99.3% ,Ad HGF能在皮层神经元中有效而持久地表达 ,接种后 2h转染Ad HGF组的细胞死亡率和凋亡率在无血清培养后 12h明显低于两对照组 (P <0 .0 5 )。结论 :Ad HGF对接种后 2h转染组无血清培养所致的损伤有显著的保护作用 ,对接种后第 5d转染的皮层神经元无血清所致的损伤虽亦具有一定的保护作用 ,但不明显。

外源性HGF对增龄和动脉硬化大鼠HGF和TGF-β1平衡的影响

目的研究携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)注入增龄及老龄脑动脉粥样硬化模型大鼠蛛网膜下腔后,HGF-TGF-β1平衡与增龄和动脉粥样硬化的关系。方法正常SD大鼠160只,随机分为增龄组(1月组、6月组、12月组、1月Ad-HGF组、6月Ad-HGF组、12月Ad-HGF组)、造模组(模型组、模型Ad-HGF组),每亚组20只,分别于第10、20、30天抽取脑脊液,用ELISA试剂盒测定HGF和TGF-β1的浓度,应用Western blot检测各组不同时间脑组织HGF和TGF-β1的浓度。结果未注射Ad-HGF的组别脑脊液中未检测到HGF,注射Ad-HGF的组别不同时间均可检测到人HGF。随着年龄增长脑脊液及脑组织中HGF含量逐渐降低,TGF-β1含量逐渐增加。造模组脑脊液及脑组织HGF含量较增龄组逐渐增加,TGF-β1含量逐渐降低(P<0.05)。结论 HGF与动脉硬化程度呈正相关,与年龄呈负相关;TGF-β1与动脉硬化程度呈负相关,与年龄呈正相关。HGF、TGF-β1水平随脑动脉硬化程度及年龄变化呈动态互逆平衡。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对血管平滑肌细胞的作用

目的:研究腺病毒载体介导肝细胞生长因子(HGF)基因感染血管平滑肌细胞后在缺氧和正常供氧时的细胞凋亡和迁移情况。方法:以肝细胞中抽提的总RNA为模板,反转录cDNA,采用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)获得HGF基因,并引入酶切位点,转染大肠杆菌,筛选阳性菌落,经酶切及测序,转染腺病毒,经三轮扩増,制备高效表达HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF),再感染人血管平滑肌细胞(VSMC)为观察组(Ad-HGF组);未感染为阴性对照组(DMEM组);以含人工合成HGF为阳性对照组(HGF组),分别在正常供氧和缺氧情况下观察细胞的凋亡和迁移情况。结果:与DMEM组及HGF组比较,Ad-HGF组在缺氧和正常供氧时VSMC的迁移率及凋亡细胞数差异均无显著性意义。结论:HGF基因感染VSMC后,在缺氧情况下并不促进VSMC的迁移,亦不抑制其凋亡。

携带HGF基因的脐带血干细胞异种移植促进烧伤创面修复的实验研究

目的探讨携带人肝细胞生长因子基因的重组腺病毒(Ad-HGF)修饰的脐血干细胞局部异种移植对烧伤创面愈合的作用。方法用密度梯度离心法检测体外分离培养人脐血干细胞,并以感染复数(MOI=100)体外转染Ad-HGF。将24只Wistar大鼠分为脐血干细胞治疗组(A组,n=8),Ad-HGF修饰脐血干细胞治疗组(B组,n=8),空白对照组(C组,n=8)。建立大鼠深Ⅱ度烧伤模型,根据不同组别将细胞悬液及生理盐水于创面下多点注射,伤后3、5、7、14、21 d观察创面收缩率并采集创面标本,行HE染色以及创面组织羟脯氨酸的测定。结果伤后7、14、21 d,B组创口收缩率高于与其他2组,差异有统计学意义意义(P<0.05);HE染色显示,3、5 d各组HE染色差异无统计学意义,7 d可见B组表皮化明显;21 d B组再生表皮明显厚于其它各组,并可见较多的新生血管和皮肤附属器生成。伤后5 d B组羟脯氨酸升高明显,与其他2组比较差异有统计学意义(P<0.05);14 d羟脯氨酸含量降低,与其他2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Ad-HGF修饰脐血干细胞异体移植可显著提高烧伤创面愈合速度和质量,为烧伤创面修复提供了新的策略。

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对冠状动脉再狭窄的预防作用

目的应用重组腺病毒载体介导的肝细胞生长因子(HGF)基因转染血管内皮细胞(VEC)及血管平滑肌细胞(VSMC),探讨HGF基因对其凋亡的诱导作用。方法以肝细胞中抽提的总RNA为模板,反转录cDNA,采用RT-PCR技术获得HGF基因,并引入酶切位点,转染大肠埃希菌,筛选阳性菌落,经酶切及测序证实后,转染腺病毒,制造病毒包涵体,经3轮扩増,制备高效表达HGF基因腺病毒载体(Ad-HGF)。以此感染VEC及VSMC,设为Ad-HGF组;再以人工合成HGF培养VEC及VSMC为阳性对照组(HGF组);以未感染Ad-HGF的细胞为阴性对照(对照组)。并采用流式细胞仪检测缺氧情况下各组细胞的凋亡率。结果VEC的Ad-HGF、HGF组细胞凋亡率均低于对照组,差异均有极显著性意义(均P<0.01),但VSMC的3组细胞凋亡率差异无显著性意义(P>0.05)。结论腺病毒载体介导HGF基因感染VEC后能在缺氧情况下有效地阻止VEC发生凋亡,但不能有效抑制VSMC凋亡,提示对冠状动脉再狭窄有预防作用。

重组腺病毒-肝细胞生长因子基因治疗延缓自发性高血压大鼠心室重构及对炎症的影响

目的该试验旨在探讨重组腺病毒-肝细胞生长因子(Ad-HGF)基因局部心肌注射对自发性高血压大鼠(SHR)左心室重构及炎症的影响。方法实验共分5组,其中自发性高血压大鼠做为心肌纤维化模型,被随机分成4组,每组6只,(1)阳性对照组(P组);(2)空白腺病毒组(A组null-Ad5,0.1 ml);(3)低剂量组(L组1×109Pfu.ml-1Ad5-HGF,0.1 ml);(4)高剂量组(H组5×109 Pfu.ml-1 Ad5-HGF,0.1 ml);另6只WKY(wista-kyoto)鼠作为正常对照组(N组);A、L,H组SHR开胸,左心室壁5点分别注射0.1 ml null-Ad5、1×109Pfu.ml-1Ad5-HGF 5×109Pfu.ml-1Ad5-HGF,基因转染后继续饲养,4周后处死。测量自发性高血压大鼠左心室质量指数,测定大鼠左室收缩压、舒张末压、压力变化最大上升和下降速率;免疫组化观察CD34(新生血管密度);ELISA法测量血浆IL-1,CRP,TNF-α;Western blot法测定HGF,NF-κB p50亚基。结果 (1)左心室重量指数:与WKY鼠对比,SHR鼠左心室质量指数明显增加,而重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗后SHR鼠左心室质量指数明显减少。(2)血流动力学检测:与SHR模型鼠对比,重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗组大鼠左室收缩压、压力变化最大上升和下降速率均明显升高,舒张末压明显降低。(3)心肌间质血管密度:与SHR模型鼠对比,重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗组大鼠心肌间质血管密度明显增加。(4)炎症因子及NF-κB p50蛋白:重组腺病毒-肝细胞生长因子治疗组与SHR模型鼠相比,血清白介素-1、CRP、肿瘤坏死因子-α明显降低,心肌组织NF-κB p50蛋白表达显著降低。结论重组腺病毒-肝细胞生长因子改善了自发性高血压大鼠的心功能。抑制炎症因子表达并促进间质血管可能是重组腺病毒-肝细胞生长因子改善心室重构的重要机制之一。

重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因对铅致动脉内皮细胞损伤的保护作用

目的观察重组腺病毒介导肝细胞生长因子基因(Ad-HGF)对铅致动脉内皮细胞损伤的保护作用,为Ad-HGF保护血脑屏障提供理论依据。方法实验设正常组、转染组、铅染组、转染加铅染毒组。转染加铅染毒组用Ad-HGF转染动脉内皮细胞48 h后,加入20μmol/L的醋酸铅,24 h、48 h后分别用G iem sa染色法观察细胞形态学变化;细胞免疫化学法检测P53的表达;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果染色显示出铅单独染毒组细胞成凋亡形态学改变。转染加铅染毒组动脉内皮细胞的免疫化学结果显示P53阳性表达较对照组下降。MTT结果表明铅处理不同时间点(6 h、12 h、18 h、24 h、48 h)后,转染加铅染毒组细胞增殖率与铅单独染毒组比较没有显著升高(P>0.05),转染组的增殖率略高于对照组(P<0.05)。醋酸铅组细胞凋亡率较对照组明显升高,转染组较未转染组比较细胞凋亡率明显下降。结论 Ad-HGF具有抗细胞凋亡作用,为解释Ad-HGF对铅致血脑屏障的损伤保护效应提供有力的理论和实验依据。