1个北村网状肢端色素沉着症大家系ADAM10基因突变研究

调查中国1个北村网状肢端色素沉着症(RAK)大家系的临床表型并检测其ADAM10基因的突变位点。回顾分析RAK大家系5代54人临床资料,并采集了家系中部分成员及100例无血缘关系的健康对照者血标本。用PCR扩增ADAM10基因所有的外显子并进行测序分析。所有患者均表现为网状的雀斑样色素沉着斑分布于手足背面及颈部,并检测到ADAM10基因的第4号外显子发生移码突变(c.425-426 delGA;p.R142IfsX2),该突变在正常家系成员及无血缘关系的正常对照中未检测到。该新的ADAM10基因突变可能导致该基因编码的蛋白截短,从而导致疾病的发生。

慢病毒介导shRNA干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖作用的研究

目的:探讨干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法:设计4对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒p LVshRNA-EGFP(2A)Puro中去,构建sh/ADAM10-1,sh/ADAM10-2,sh/ADAM10-3,sh/ADAM10-4和sh/Con;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MM.1S细胞,流式细胞术分选GFP+细胞。利用实时定量PCR及Westem blot检测慢病毒载体介导的shRNA干扰ADAM10基因的作用。选取ADAM10下调最显著的细胞株,CCK-8法检测干扰ADAM10后细胞的增殖,Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测促凋亡基因BAD、BAK、BIK抑凋亡基因BCL-2、c-Myc以及Notch1及其下游靶基因Hes-1的转录变化。结果:成功构建了特异性干扰ADAM10表达的慢病毒载体,干扰ADAM10基因对MM.1S细胞的增殖具有抑制作用,并能诱导MM.1S细胞的凋亡,且促凋亡基因BAD、BAK表达升高,抑凋亡基因BCL-2、c-Myc表达降低。Q-PCR结果显示,干扰ADAM10后Notch1水平升高,Hes-1水平降低。结论:干扰ADAM10基因可显著抑制MM.1S细胞的增殖,促进其凋亡,其机制与Notch1信号通路有关。

RNAi技术沉默星形胶质细胞Adam10基因模型的建立

目的:建立离体星形胶质细胞Adam10基因沉默模型。方法:体外培养SD大鼠乳鼠星形胶质细胞,采用免疫荧光方法标记胶质纤维酸性蛋白(GFAP)以鉴定星形胶质细胞及其纯度。通过RNA干扰(RNAi)技术,使用转染试剂Lipofectamine2000将靶向作用于大鼠Adam10基因的si RNA序列转染至星形胶质细胞内,通过Real time-PCR和Western blotting技术在RNA水平和蛋白水平检测沉默效率。结果:靶向作用于星形胶质细胞Adam10基因的si RNA序列成功转染入星形胶质细胞,并且转染Adam10基因靶向干扰序列的星形胶质细胞Adam10基因的表达在RNA水平和蛋白水平较阴性对照组明显降低(P<0.05)。结论:可以通过RNAi技术建立离体星形胶质细胞Adam10基因沉默模型。

miR-122-5p通过ADAM10基因抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移的研究

目的研究微小核糖核酸122-5p (miR-122-5p)对卵巢癌细胞的作用及机制。方法应用miR-122-5p转染卵巢癌细胞系A2780和SKOV3,测定转染后细胞活性、集落形成和凋亡情况,以及侵袭迁移能力的变化。应用TargetScan工具预测miR-122-5p的可能靶基因,并应用荧光素酶检测方法判定miR-122-5p对其靶基因表达的调节作用。应用miR-122-5p转染卵巢癌顺铂耐药株A2780/DDP检测转染后顺铂的半数抑制量(IC50)的变化。结果 miR-122-5p抑制卵巢癌细胞增殖、侵袭和转移,诱导癌细胞的凋亡。这种作用在引入ADAM10基因后得以逆转,证明ADAM10是miR-122-5p的一个重要靶基因。miR-122-5p在人类卵巢癌顺铂耐药细胞株A2780/DDP中表达下调,过表达miR-122-5p能明显降低该细胞株的IC50。结论 miR-122-5p抑制卵巢癌细胞增殖和迁移,并能逆转癌细胞对顺铂的耐药性。

猪ADAM10基因编码区及其剪接体克隆、序列分析与组织表达研究

旨在克隆猪ADAM10基因及其剪接体的编码区(Coding sequence,CDS),利用生物信息学方法分析其序列结构和生物学功能,并揭示ADAM10基因及其剪接体mRNA在猪组织中的表达特征。根据GenBank中公布的猪ADAM10基因的序列信息,设计特异性引物,运用反转录PCR(Reverse transcription-PCR,RT-PCR)方法结合T/A克隆技术进行ADAM10基因及其剪接体编码区的克隆,利用生物信息学方法分析ADAM10及其剪接体蛋白的结构,同时用半定量PCR(Semi-quantitative PCR)分析猪ADAM10基因完整型及其剪接体mRNA在猪不同组织中的表达谱。结果显示,克隆和测序获得两种ADAM10CDS序列,其中完整型CDS长2 247bp,编码748个氨基酸;剪接型CDS缺失外显子2~7和部分外显子8,其长度为1 344bp,编码447个氨基酸。和完整型蛋白相比,猪ADAM10剪接体编码的蛋白不存在前引导序列,但存在完整的信号肽序列和跨膜结构域,并含有金属蛋白酶域和解聚素结构域,其三级结构也和完整型一致。序列比对和进化树分析表明,猪ADAM10完整型蛋白在物种间具有较高的保守性。半定量PCR分析表明,ADAM10基因完整型mRNA在脾中表达量较高,在肾、乳腺、腿肌、输卵管、卵巢、子宫、小肠等组织中低水平表达;ADAM10基因剪接体mRNA在肺中表达量较高,在脾和胃中也有低水平表达。本研究为进一步探究猪ADAM10基因的结构和生物学功能提供了基础资料。

北村网状肢端色素沉着症1例及ADAM10基因新型突变分析

目的 检测分析1例表现为肢端皮肤色素沉着伴点状凹陷患者的基因变异情况。方法 收集患者及其父母的临床资料及外周血,通过二代测序及Sanger测序技术发现并验证基因突变。结果 患者临床表现符合北村网状肢端色素沉着症,基因检测发现ADAM10基因c.1715G>T(p.Cys572Phe)杂合突变,患者父母及正常对照均未发现此位点变异。结论 北村网状肢端色素沉着症具有独特的临床表现和皮肤镜特点,ADAM10基因c.1715G>T(p.Cys572Phe)为新型错义突变,可能是其病因之一。

解整合素-金属蛋白酶10基因与儿童哮喘的相关性分析

目的 探讨我国中部地区儿童中ADAM 10基因的2个SNP位点,rs 653765和rs 514049的多态性与哮喘及其临床特点的相关性。方法 采用病例对照研究方法,选取221例哮喘患儿和236例同期体检正常儿童作为研究对象,利用限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）方法检测2个SNP位点的多态性分布;采用ELISA方法测定血浆中的ADAM 10的水平。结果 哮喘患儿rs 653765的三种基因型（CC、TC、TT）与正常对照组差异具有统计学意义（χ~2=7.163,P=0.028）;等位基因频率的差异也具有统计学意义（P=0.008）,T等位基因为风险因子。哮喘患儿rs514049的基因型以及等位基因频率与对照组差异无统计学意义（χ~2=1.011~0.844,P均〉0.05）。哮喘组和对照组之间血清中ADAM10水平的差异无统计学意义（t=1.233,P=0.238）;哮喘患儿中,rs653765为TT基因型患儿的ADAM10水平高于CC基因型患儿,差异有统计学意义（P=0.034）。结论 ADAM10基因SNP位点（rs653765）的多态性与我国中部地区儿童哮喘的易感性相关;且该位点多态性可能影响患儿ADAM10水平。